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第100章 蛋白质定量方法

常用的蛋白质定量方法有BCA法、Lowry法、考马斯亮蓝法和紫外分光光度法。试剂盒中,最常用的标准品是牛血清白蛋白(BSA)。

一、BCA法

BCA(Bicinchoninic acid)法是理想的蛋白质定量方法。该方法因快速灵敏、稳定可靠,对不同种类蛋白质检测的变异系数非常小而倍备受专业人上的青睐。该方法的原理是,在碱性条件下,蛋白将CU(上标2+)还原为cu(上标+),Cu(上标+)与BCA试剂形成紫色的络合物,测定其在562nm处的吸收值。并与标准曲线对比,即可计算待测蛋白的浓度。BCA法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响。在组织细胞裂解实验中,低浓度的去垢剂SDS,Trition X-100,Tween不影响检测结果,但螯合剂(EDTA,EGTA)、还原剂(DTT,巯基乙醇)和脂类会对检测结果有一定影响。实验中,若发现样品稀释液或裂解液本身背景值较高,可试用Bradford法测定蛋白浓度。

二、Bradford法

Bradford比色法是基于考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式,在一定浓度的乙醇及酸性条件下,可配成淡红色的溶液,当与蛋白质结合后,产生蓝色化合物,化合物颜色的深浅与蛋白浓度的高低成正比关系。Bradford比色法比Lowry法测定蛋白浓度更简单迅速。用脱氧胆酸/三氯乙酸沉淀蛋白可排除甘油、去污剂、2-巯基乙醇、乙酸、硫酸铵、Tris和一些碱性缓冲系统的干扰。分别在两组微量离心管中各加入0.5mg/ml牛血清白蛋白(5、10、15和20L),以0.15mmol/LNaCl补足至100 L,同时以两管100L的0.15mmol/L NaCl作空白对照。每管各加入1ml考马斯亮蓝染料溶液,振荡混匀,室温放置2min。用1cm光径的微量比色杯测A595,取A595吸光值对标准蛋白浓度作图,画标准曲线,并测量待测样品的A595。从BSA标准曲线中确定待测样品的浓度。

Bradford的dye-binding method是利用Coomassie brilliant G-250(CBG)可与蛋白质结合而变色的特性来定量(Bradford,1976);若试样中的蛋白质量较多,则结合到蛋白质而变色的CBG也多,因而呈色较深。下例是以一组标准蛋白质为对象,制作一条蛋白质量与吸光度的标准校正线。

【实验前准备】

(1)仪器用具ELISA光度计(Dynatech)可在1min内测完一片滴定盘微量滴定盘(microtiter),Micro test tubes,大头针或喷火枪。

(2)药品试剂Buffer A-O;BSA标准品(Bio-Rad,bovine serum albumin100μg/ml);未知浓度样本(unknown BSA,0.8ml);Dye Reagem(Bio-Rad 500-0006)先以水稀释4倍备用。以染料Coomassie brilliant blue G-250配制的溶液,勿与胶体电泳染色用的CBR-250混淆,各有其使用上的特色,不要互用。

(3)标准品及样本

①标准品系列:使用小试管准备一组BSA(b)标准品的系列稀释。

标记BSA标准品(μl)BufferA-O(μl)终浓度(μg/ml)

#5 500 0 100混合均匀

#4 400 100 80混合均匀

#3 300 200 60混合均匀

#2 200 300 40混合均匀

#1 100 400 20混合均匀

#0 0 500 0混合均匀

配制一定要精准,否则校正直线不会很准确;各种试剂的添加,若自稀往浓取样,则可以不用换吸管头。

标记未知样本BufferA-O终浓度

X(下标1)500μl 0μl 2×混合均匀

X(下标2)250μl 250μl 1/2×混合均匀

②未知样本:准备两种未知样本。

③一般样本:通常由色谱层析法所收集到的各分层样本,都可以直接进行蛋白质定量分析;但若其中含有某些干扰因子(如含有Triton),或样本的浓度太浓,都必须将样本稀释后再测。同一样本的若干不同稀释浓度,所测出来的最终蛋白质浓度会有差异,通常是以稀释度大者较为准确。

【操作步骤】

(1)每槽先加好50μl标准品(#0,#1…#5)或未知样本[x(下标1),x(下标2)],加入96孔滴定盘中,共两个平行孔。

(2)每槽再加入200μl Dye-Reagent(d),在全部样本槽加完前,不要中断添加;同时小心避免气泡产生。

(3)轻拍滴定盘一侧,使添加的各成分均匀混合,注意Dye-Reagent密度较大,很容易沉积在下方而分层。若还有小气泡,小心以大头针刺破,大量时可用喷火枪火焰烧破。

(4)静置室温10min。

(5)以ELISA reader测量570nm(或595 nm)的吸光值。

三、双缩脲法

当需要快速,但不很准确的测定中,常使用双缩脲法。双缩脲法的原理是Cu(上标2+)与蛋白质的肽键,以及酪氨酸残基络合,形成紫蓝色络合物,此物在540nm波长处有最大吸收。双缩脲法常用于0.5~1Og/L含量的蛋白质溶液测定。干扰物有硫醇,以及具有肽性质缓冲液,如:Tris缓冲液等。可用沉淀法除去干扰物,即用等体积10%冷的三氯醋酸沉淀蛋白质,然后弃去上清液,再用已知体积的lmol/L NaOH溶解沉淀的蛋白质进行定量测定。

四、紫外分光光度法

大多数蛋白质在280nm波长处有特征的最大吸收,这是由于蛋白质中有酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸存在的缘故。因此,利用这个特异性吸收,可以计算蛋白质的含量。如果没有干扰物质的存在,在280nm处的吸收可用于测定0.1~0.5mg/ml含量的蛋白质溶液。部分纯化的蛋白质常含有核酸,核酸在260nm波长处有最大吸收。有核酸时,所测得的蛋白质浓度必须做适当校正。由于各种蛋白质所含芳香族氨基酸的量不同,因此浓度为0.1%的各种蛋白质在280nm处的吸光系数在0.5~2.5之间变化。所有的噩白质在230nm以下都有强吸收。例如,0.1%牛血清白蛋白的消光系数α在225nm和215nm处分别为5.0和11.7,而在280nm处为0.58。在230nm以下的强吸收是由于肽键的存在,因此该值对所有的蛋白质都是一样的。从215nm和225nm处的光密度之差可用于测定浓度为10~100μl/ml的蛋白质。

缺点:该方法不是严格的定量,因为此法是根据酪氪酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)和色氨酸(TrP)残基的强吸收值来测定的。不同的蛋白质具有不同的消光系数,如果一种蛋白质中没有上述3种残基,此法就不能检出,但对于粗提蛋白成分的混合物来说,此法合适。

【实验前准备】

(1)试剂实验用缓冲液(空白对照)。

(2)设备分光光度计(配备紫外档)、石英比色杯、移液管和吸球。

【操作步骤】将缓冲液和待测样品分别加入比色杯,用对照杯(实验用缓冲液)调零,记录各样品的光吸收值。

【注意事项】

(1)通常误认为用1cm的比色杯所测光吸收值为1.0时,蛋白质溶液浓度大约为1mg/ml,这是很不精确的。以下比较了不同的标准蛋白质在1mg/ml时的光吸收值。

(2)玻璃和塑料在紫外吸收光范围内具有光吸收值,因而不能用来进行蛋白质的定量。

(3)当有核酸存在时,可进行如下修正:蛋白质浓度(mg/ml)=1.5×A(下标280)0.75×A(下标260)。

(4)如果测量值超过测量范围,应将样品用缓冲液稀释后再测量,或使用更小的比色杯测量。

表5-3不同的标准蛋白质在1mg/ml时的光吸收值

蛋白质A(下标280)蛋白质A(下标280)

牛血清白蛋白0.70γ-球蛋白1.38

核糖核酸酶A 0.77胰蛋白酶1.60

卵白蛋白0.79胰凝乳蛋白酶2.02

肠毒素1.33α-淀粉酶2.42

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