1977年，Paterson发现外源性核苷酸可调节基因表选；1978年，Stephenson和Zammeenik首次报道了反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide，AS－ODN）可抑制劳斯肉瘤病毒（RSV）增殖。1984年，Izant和Weintraub又提出了“反义核酸技术”的概念，即根据碱基互补原理，用人工合成或生物合成的特定互补的DNA或RNA序列，导入靶细胞，形成mRNA－DNA或mRNA－RNA杂交双链，从而抑制或封闭基因表达。使其丧失活性，达到基因控制和治疗的目的。反义核酸是指与目的DNA或RNA以碱基配对原则互补结合的能够抑制目的基因表达的核酸。广义上包括反义DNA（antisense DNA）、反义RNA（antisense RNA）、核酶（ribozyme）和反义寡聚核苷酸4类。现在人们广泛应用人工合成的反义寡核苷酸抑制真核细胞基因、癌基因、病毒基因及其他内源基因的表达，其已经成为一种重要的抗肿瘤、抗病毒候选药物。经过20年来的基础研究，伴随着先进的基因克隆和基因测序技术的出现，以及DNA合成技术的迅速发展，针对癌基因、生长因子及其受体、信号传导通路等设计的反义核酸已有可能调控基因表达或抑制一些有害基因或失控基因的过度表达，有希望成为分子水平治疗各种疾病如艾滋病、癌症、病毒感染、高血压、慢性感染性疾病和遗传性疾病等新的突破口，受到世界范围内的广泛重视。
一、反义核酸技术的作用机制和分类
1．反义核酸技术作用机制
脱氧核糖核酸上携带编码蛋白质的氨基酸信息的核苷酸序列，称正义链（sensestrand），另一条与正义链互补的核苷酸序列称反义链（antisense strand）。As－ODN与靶mRNA上特定序列以Watson－Crick碱基配对原则杂交，从而抑制或阻断了mRNA基因的表达。统计表明，人类基因组中只能出现一次的核苷酸序列数目平均为13个。基于这一点，理论上设计一个有15个以上碱基（15～25个碱基）特异序列的ODN能针对人类基因组中任何的单个基因作为靶点，从而调控基因表达。Yo－shikawa等报道AS－ODN干预转录、mRNA前的剪接和翻译过程，可竞争转录、蛋白合成或致mRNA降解。
迄今为止，AS－ODN的作用机制尚未完全清楚，但较多理论和实验表明其可能的机制为：①设计AS－ODN定向互补到靶mRNA，严格按Waston－Crick碱基互补配对，与mRNA的5＇端的SD（Shine－Dalgarno）序列或5＇末端编码区（主要是起始密码AUG）结合，改变mRNA的二级结构，抑制mRNA的表达。还可能阻断mRNA从核内进人胞浆，使其蛋白质的翻译过程不能正常进行，从而阻断了翻译过程。有研究发现AS－ODN与mRNA之编码区配对结合就足以阻断，mRNA的翻译功能，而另外一些研究则证明AS－ODN与mRNA的5＇端非翻译区（是高度保守的序列）的结台才能取得最佳结果。②As－ODN能穿过核膜，进人细胞核内，以Hoogsteen键连接到核内基因组DNA，即ODN直接与DNA双链的特定部位结合形成三聚体，阻断转录过程。③可结合到前体RNA（h nRNA）的外显子和内含子的连接区，形成双链，干扰h nRNA剪切得成熟RNA；作用于mRNA的poly A形成位点，阻止成熟和转运。④ODN与mRNA形成的双链与DNA双链竞争转录因子的结合，导致转录过程不能启动，转录被阻断。⑤As－ODN与靶mRNA杂交后诱导核糖核酸酶H的活性，核糖核酸酶H具有定点切割RNA的作用，从而大大缩短了mRNA的半衰期。⑥核酶为一类具有生物催化功能的小分子RNA，具有特定的碱基序列，能结合特定靶序列，以酶的效率催化水解靶序列，又称“基因剪刀”。⑦非特异性的作用机制是AS－ODN与靶蛋白以aptamer式连接，从而抑制了蛋白质的加工、修饰及功能的表达。
2．反义核酸的种类
反义核酸通常根据其作用方式可分为三类。①人工反义RNA表达载体的构建：用DNA重组技术，在适宜的启动子和终止子之间反向插入一段靶DNA在表达载体（病毒、质粒）上，导入靶细胞直接转录出反义RNA，与相应mRNA形成双链，阻断mRNA的翻译过程。②人工合成或生物合成的脱氧寡核苷酸0DN：一般由17～25个碱基组成，可随意设计合成序列，以胞吞的方式进入细胞与相应的RNA结合发挥作用，是目前最常用的途径但由于其易被核酶降解。在细胞内的半衰期30min左右，故多用于体外研究。③利用诱导物诱生体内的反义核酸。核酶（ribozyme）是一类能在特异序列位点催化RNA切割的小片段ODN链。其作用原理是核酶特异性序列通过互补碱基对形成识别并结合特异性靶RNA，催化核心则以酶的效率催化裂解靶RNA，使目标失活并无法恢复，从而达到治疗目的。
二、反义核酸技术中寡核苷酸的序列设计、摄取及转运
1．反义寡核苷酸的设计
应考虑到其在体内的稳定性、能容易地进入细胞并与靶序列高亲和性结合且不产毒性，与靶序列结合后特异性抑制靶基因地表达。所以选择反义DNA或反义RNA时。为使之特异地结合mRNA上，一般至少15个核苷酸，最长不超过20～25个，太长的反义核苷酸很难进入细胞内，一般选用18个核苷酸左右为宜，其中G－C质量分数应在60％～65％。所以长的反义RNA并不比短的反义RNA有效。
在原核生物中，针对SD序列及其附近区域的反义RNA可能有效。真核生物中，对应5＇端非编码区的反义RNA可能比针对编码区反义RNA更有抑制作用。反义RNA中不应有开放读框，否则该反义RNA会与核糖体结合而影响其与靶mRNA的配对结合。作用于顺序中mRNA 5＇帽子形成位点、或者3＇端非翻译区、mRNA 5＇端非翻译区、mRNA编码区（主要是起始密码），这些区域的As－ODN可产生明显的抑制功能。但高效低毒的反义寡核苷序列设计尚无明确的规律，要证实反义寡核苷对靶mRNA的特异性抑制、排除非特异作用机制，除检测靶mRNA表达及蛋白质外，更重要的是要设立必要的对照。常用的对照有正义链（sense）、错义链（missense）及反义链（antisense）。
2．反义寡核核酸的摄取
反义寡核苷酸通过胞饮进入细胞或与细胞表面抗原结合后，通过受体介导的入胞作用进入细胞。不带电荷的寡聚体通过被动扩散，带电荷寡聚体通过胞饮作用进入细胞。反义寡核苷酸能在核内或溶酶体内长期螯合，这已引起人们对其在细胞内的有效性和稳定性的关注。已有很多方法可增加反义寡核苷酸的细胞摄入，如与胆固醇结合或用阳离子脂质体进行核酸传递，但此种方法的主要缺点是包裹效率仅在3％左右。反义寡核苷酸进入细胞后能通过核孔扩散，并在核内聚集。
3．微粒给药系统
作为定位于胞浆而发挥药效作用的反义寡核苷酸，应用的关键之一是要克服其细胞摄取率不高的缺点。近年来，微粒给药系统的发展为解决这一问题带来希望，脂质体是较有前途的载体之一。中性脂质体作用较差，这可能与其包封率不高以及不易与细胞膜相互作用等原因有关。由于反义寡核苷酸是多聚阴离子，且细胞膜上带有一定负电荷，因此可以设计带正电荷的脂质体，通过静电作用形成复合物，即可提高载药量，）又能增加细胞的摄取。研究表明，脂质体正电荷与核酸负电荷的比例是影响复合物载药量和细胞摄取量的重要因素。事实上，细胞转染是一个复杂的过程，其中还涉及到入胞机制，目前认为内吞是主要途径。因此提示除电荷因素外，尚有多种因素影响着转染效率。如Monia用lipofevtin介导反义寡核苷酸转染时，在正负电荷比为2：3时效果最好。而Capaccioli等用同样的脂质体在正负电荷之比为1：14时取得最佳转染效果。脂质体表面的电荷密度、培养基的种类以及细胞株的类型、体内各种调理素（opsonin）等都是影响转染效果的因素。
靶向转运系统可能解决反义寡核苷酸摄取及转运问题。已研究的特异性靶向技术包括受体介导的靶向转运、免疫脂质体靶向及毫微粒靶向、信号肽转运（signalpeptide，SP）或HTVgp41蛋白融合序列的寡肽载体等，而且后两者，不需要经过内吞过程，可以有效地将反义核酸转运至细胞核。
三、反义寡核苷酸的剂量、给药途径和方式以及毒性
1．反义寡核苷酸的剂量
在不同的临床前药效研究中寡核苷酸的有效剂量不同，与下列因素有关：①所用动物的种系及疾病的种类；②寡核苷酸的化学性质；③给药方法和途径。所以，有效剂量尚有待于探索。
2．给药途径和方式
在体内实验中，可以全身给药。为了避免多次给药，可采用微渗透泵等装置。优点在于能持续释放药物，维持有效浓度；缺点在于用药结束后必须手术去除。对临床应用来讲，生物体兼容的、生物学上可降解的持续释放装置更好一些。现有利用腺病毒在体内表达相应的反义核苷酸，以达到治疗目的。对较为局限的病灶可局部给药，采用局部注射或局部微渗透泵。
3．反义寡核苷酸的毒性
反义寡核苷酸的毒性与动物种类和用药剂量有关。腹腔或皮下给药，与其在体内的分布特点相符，有可能分布除脑以外的各种组织，对肾脏、肝、脾、骨髓等系统器官产生一定的毒性作用，大部分As－ODN最终在网状内皮系统的器官中积累。因此，这些器官既是其发挥作用的场所，同时有可能受到侵害。也有报道，在小鼠和大鼠中，寡核苷酸的毒性与序列相关。对灵长类动物猴的实验中，寡核苷酸的毒性与其化学修饰相关。
四、常见的人工合成的反义寡核苷酸
自然状态下的As－ODN，分子量小，不稳定，半衰期短，易被细胞内广泛存在的核酸酶降解。为增加其稳定性和提高对细胞膜的穿透性，必须进行适当的化学修饰。反义核苷酸成分碱基、磷酸和核糖中，磷酸基因修饰最为常见，即磷酸二酯酶中的氧被甲基、硫基和乙基替代。①硫代磷酸化反义核苷酸（S－oligos）：用硫代磷酸酯骨架代替磷酸酯骨架，其物化性质与正常核酸片段相似，它可通过受体作用完整地进入细胞内，具有更强的抗核酸酶的活性，还可以增加反义核酸的穿透力和与靶序列的亲和力。由于硫代寡核苷酸易合成，毒性小，血清中清除率慢，成为目前反义应用研究最多的一种修饰寡核苷酸。②甲基化寡核苷酸（M－oligos）；可对抗细胞内酶的水解，对细胞无毒性作用，已用于培养细胞上，抑制病毒基因或内源性基因的表达。③聚酰胺核酸：又称肽核酸（peptide nucleic acids，PNAs），其保留核酸结构中最主要的碱基结构，其他两种结构（戊糖和磷酸残基）已变成线性酰胺结构，故PNA是一连串的酰胺基相连的长链与一系列单个碱基相连；多肽骨架结构替代寡核苷酸中的糖－磷酸骨架的新型物质。肽核酸不具有3＇→5＇的极性，可与核酸正向或反向结合，不易降解，半衰期较长，可以有效地抑制翻译与转录过程，现已成为一种有潜力的反义分子。
近年来随着As－ODN纯化台成的研究技术进展，多种化学修饰的As－ODN问世，其中最具代表性的是第一代反义核酸药物的硫代As－ODN，但与天然结构反义核苷酸相比，其与靶mRNA特异结合能力减弱；与一些细胞因子、受体、蛋白结合能力增强，可受到RNA核酸酶降解等缺点。因此在应用中，提高As－ODN的稳定性和保持其生物学活性是选择As－ODN化学修饰物的关键因素。尽管反义核酸及其修饰产物与细胞表面的受体结合，通过细胞胞饮作用进入胞质和细胞核，但体内使用时，将As－ODN连接到特定的表达载体（如胆固醇，L－多聚赖氨酸、转铁蛋白以及阳离子或抗体靶向性脂质体），可以通过内吞作用进入细胞内，减少As－ODN的用量，避免了溶酶体的降解消化，增加了细胞内AS－ODN的含量，更为有效的发挥效应。
