①原理：用C8166细胞作为指示细胞与HIV－1慢性感染的H9细胞共培养6～8h，观察合胞体的形成情况。如果化合物能干扰病毒包膜糖蛋白gp120与CD（下标4）受体的相互作用，不但能一直病毒吸附到宿主细胞，而且能一直病毒诱导的合胞体的形成。这种方法可以明确化合物是否影响pg120－CD（下标4）的结合，区分早期或晚期过程以及影响病毒结合细胞的其他分子。
②方法：在96孔细胞培养板上，将待测化合物倍比稀释，每孔100μl。同时设置不含化合物的阳性对照孔。T20为阳性药物对照。每孔滴加6×10（上标5）个／ml C8166细胞50μl和2×10（上标5）个／ml的HIV－1慢性感染的H9／HIV－1ⅢB细胞50μl。于37℃、5％CO（下标2）培养6～8h，在显微镜下计数合胞体数。EC（下标50）为抑制融合50％时的化合物浓度。
（2）抑制病毒与细胞吸附实验
①原理：HIV颗粒在4℃与HIV宿主细胞孵育2h即可吸附在细胞膜上，洗掉游离病毒，观察合胞体的形成情况，如果化合物能干扰病毒吸附到细胞膜上，即能抑制病毒诱导的合胞体的形成。
②方法：在1．5ml离心管中加入50μl不同稀释浓度的药物，再加入8×10（上标5）个／mlC8166细胞悬液50μl。美观接种HIV－1培养上清原液。设阳性药物DS对照、不含药物的阳性对照和阴性对照管。4℃孵育2h，洗涤3次，600μl／管PRMI－1640完全培养基重悬后加入96孔板中，每个浓度的药物设3个复孔，终体积200μl。37℃、5％CO（下标2）培养箱孵育。第3天观察待测化合物对合胞体形成的影响。在倒置显微镜下选取5个不重叠的视野，计数合胞体数并计算EC（下标50）。
（3）直接杀病毒作用
①原理：将药物加入HIV－1储存液，直接作用不同的时间段，稀释后感染C8166细胞，观察合胞体的形成情况。如果化合物有直接杀病毒作用，则病毒被杀死，抑制病毒诱导的合胞体的形成。
②方法：将不用稀释度的100μl药物与100μlHIV－1上清混合，同时设置阳性药物次氯酸钠、阴性对照及阳性对照孔，37℃或室温孵育1、5、10、30和60min，吸1μl上述混合液到已加好4×10（上标4）个／孔的C8166细胞的96孔板中。37℃、5％CO（下标2）培养3天，倒置显微镜下（100×）计数合胞体个数，计算EC（下标50）及抑制合胞体形成50％时的药物维度。
（二）分子水平筛选检测抗HIV药物方法
1．病毒进入抑制剂的筛选方法
HIV侵入宿主细胞时病毒复制循环中早期的关键过程，由3个主要的步骤组成：首先是HIV包膜糖蛋白pg120与靶细胞上的CD（下标4）分子结合；其次，pg120构象变化和辅助受体（CCR5或CXCR4）结合；最后导致gp41的构型发生改变，形成6股螺旋束核心结构，将病毒包膜与靶细胞膜拉近并发生融合，完成病毒进入宿主细胞的感染过程，从病毒侵入机制的角度，HIV进入抑制可分为三大类：一是干扰gp120与CD（下标4）受体结合的吸附抑制剂；二是辅助受体拮抗剂；三是阻止gp41核心结构形成的融合抑制剂。
（1）化合物对HIVgp120与CD（下标4）受体结合的抑制作用方法：将纯化的CD（下标4）铺板至96孔ELISA板上，然后在不同浓度待测化合物存在时，加入HIVgp120及其多抗，然后加入合适的二抗，通过底物反应检测CD（下标4）与gp120的结合量。这种筛选可明确化合物是否影响gp120和CD（下标4）的结合，区分早期或晚期过程以及影响病毒结合细胞的其他分子。
（2）化合物对HIV辅助受体的抑制作用I（上标125）标记配体结合测定法：巨噬细胞炎症蛋白1α（MIP－α）、MIP－1β和RANTES等趋化因子是CCR5的天然配体，而基质衍生因子（SDF－1）、IL－8是CXCR4的天然配体，利用（上标125）I标记这些配体，并与其相应的受体结合后，液闪仪检测被洗脱的配体，并计算化合物对辅助受体与配体结合的抑制率。
（3）化合物对HIVgp41的抑制作用通过ELISA方法检测化合物对NHR和CHR相互作用的影响来检测化合物对gp41融合核心形成的抑制作用。方法为在96孔ELISA板上加入NHR、待测化合物和CHR共同孵育，然后加入生物素标记的gp41融台核心的单抗，再加入二抗最后显色。根据与不含待测化合物的对照孔OD值的比较可以得到待测化合物不同浓度的抑制率和EC（下标50）值。
2．作用于病毒酶靶标的化合物的筛选方法
（1）化合物对HIV逆转录酶活性的抑制作用逆转录酶（RT）是抗HIV药物的主要靶点之一。在RT作用下，HTV（＋）链单股RNA被逆转录成双链DNA前病毒，然后进入细胞核并在整合酶的作用下宿主细胞的染色体整合。HIV的RT具有多种活性功能：依赖于RNA的DNA聚合酶活性；依赖于DNA的DNA聚合酶活性；核糖核酸酶H活性。根据RT的活性功能可以设计不同的实验。
①利用RT的RNase H活性检测RT活性：以polyA（dT）15为引物，以合成的DNA或RNA片段为模板，反应体系中加入同位素或非同位素标记的核苷酸，在待测化合物存在或不存在时，检测标记核苷酸掺入率，计算出化合物对RT DNA或RNA聚合酶活性的抑制程度。或者在合成RNA片段的3′端机器互补序列的5′端分别标记荧光发光基团和淬灭基团，并退火使之形成标记的双链RNA，当RT与之作用时，RT的RNase H活性将切割RNA的3′端，使其中一个基团脱离，从而使反应体系发出荧光。在化合物存在或水存在时，将重组RT与退火后的双链RNA共同孵育，检测反应体系的荧光强度变化，即可检测化合物对RT的RNase H活性的抑制情况。
②HIV RT的DNA链转移活性抑制剂筛选：利用RT对DNA链转移的催化来检测RT的DNA聚合酶活性和RNase H活性。5′－生物素标记的DNA引物和5′端缺乏保密点的RNA模板退火，DNA受体模板3′端与RNA模板同源5′端含polyC的尾巴。加入dATP、dTTP、dCTP和（上标3）H标记的dGTP，由于RNA模板中缺乏C，只有dA、dT和dCMP掺入到转移链中。DNA链转移后，（上标3）H标记的dGTP才能掺入链中，标记DNA产物被链亲和素包被的SPA微球捕获，在（上标3）H发出的β射线作用下，微球内的闪烁剂被激发而发出冷光，液闪仪分析。
③非核苷类RT抑制剂对体外重组RT活性的检测：以购自Roche公司的RTAssay试剂盒为例。将化合物溶解于DMSO中。取出试剂盒中反应条，每孔滴加20μlHIV－1 RT溶液、13μl裂解缓冲液、7μl溶于DMSO的化合物、20μl含模板和核苷酸的反应缓冲液。化合物的终浓度为200μg／ml。设置膦甲酸钠阳性对照孔和不含化合物的阴性对照孔。置37℃1h。洗涤5次后，每孔加入200μl抗DIG－POD抗体工作液。37℃温育1h，洗涤5次。每孔滴加200μl ABTS底物反应液。室温反应15～30min，酶标仪测定OD值（405nm／490nm）。以抑制RT活性＞50％的化合物判定为初筛阳性。将初筛刚性化合物用裂解缓冲液进行倍比稀释，每个浓度设3个复孔。按上述方法测定其对RT活性的抑制。
（2）化合物对HIV蛋白水解酶活性的抑制作用HIV蛋白水解酶（PR）在HIV病毒颗粒的成熟中起着重要作用。PR在Gag－pol前体蛋白水解加工成结构蛋白（如基质蛋白、衣壳蛋白和核衣壳蛋白）和病毒颗粒各种酶（如蛋白水解酶、逆转录酶和整合酶）的过程中是必需的。抑制Gag和Gag－pol含有7个蛋白水解酶的酶切位点，其中3个位点具有共同的特异性氨基酸残基序列：（Ser／Thr－Xaa－Xaa－（Tyr／Phe）。PR抑制剂往往是其底物类似物，抑制剂可以竞争或非竞争的方式结合于PR的活性中心。
①HPLC检测法：以多肽Ac－Arg－Ala－Ser－Gln－Asn－Tyr－Pro－Val—NH（下标2）或Ac－Ser－Gln－Asn－Tyr－Pro－Val－Val－NH（下标2）为水解底物，在待测化合物存在或不存在时，以HPLC分析PR的水解多肽的产物，计算出化合物对PR活性的抑制程度，可得出化合物的Ki和EC（下标50）。
②FRET检测法：利用荧光共振能量传递（FRET）。
【原理】在合成的蛋白酶底物Abu－Ser－Gln－Asn－Tyr－Pro－Ile－Val－Gln两端分别标记荧光发光基团EDNAS和荧光淬灭基团DABCYL，EDNAS在355mm光波激发下能够发出最大发光波长为490nm的荧光，DABCCYL能够在490nm下吸收荧光。但蛋白酶底物完整时，发光基团发出的荧光被淬灭基团吸收，整个反应体系不发光；当蛋白酶底物被切割后，发光基团离开淬灭基团，淬灭效应降低甚至消失，反应体系发出荧光。
【方法】在黑色96孔板上建立100μl反应体系。蛋白酶1：30稀释至反应缓冲液中，终浓度为4．75ng／μl。加入不同浓度的待测样品后轻轻混匀，25℃温育15min。加入荧光标记的蛋白酶底物至终浓度2μmol／L，混匀后用荧光酶标仪检测起始荧光值。25℃反应90min，用荧光酶标仪检测终止荧光值。设置不加抑制剂的对照孔。计算抑制率，抑制率（％）＝100％－待测样品荧光读值变化量／对照孔荧光读值变化量×100％，求出待测样品对蛋白酶的抑制程度。据此可求出待测样品的EC（下标50）。
（3）化合物对HIV整合酶活性的抑制作用
HIV整合酶（IN）是HIV复制必需的酶，是由基因3′端编码的相对分子质量为32000的二聚体酶，由水解Gag－pol多聚蛋白产生，含N端结构域、C端结构域和核心结构域。IN在体外有三方面活性：①3′加工，去除病毒DNA3′端的两个核苷酸，使其暴露CA－OH－3′端，以便整合进靶DNA；②DNA链转移，使病毒DNA的3′端与靶DNA插入位点的5′端连接；③去整合作用，IN也有使整合DNA从靶DNA上解脱下来的作用。
IN抑制剂的作用方式主要有3′加工抑制和链转移抑制两种。作用机制主要有：与IN的底物结合位点结合，与底物DNA竞争；诱导IN活性中心天冬氨酸－64－天冬氨酸116－谷氨酸152催化三联体（DDE基序）的构想改变或者封闭此催化三联体；螯合金属离子，影响酶活性；与底物DNA相互作用干扰酶活性。
①表面等离子共振检测法
a．原理：表面等离子共振（SPR）是指当入射光以临界角人射到两种不同透明介质的界面是将产生全反射，在界面上镀上金属膜后，入射光可引起金属中自由电子的共振，从而导致反射光在一定角度内大大减弱，其中使反射光完全消失的角度称为共振角。共振角随金属膜表面通过的液相的折射率的改变而改变，二折射率的变化与结合在金属表面的生物分子的分子质量呈正比。通过检测共振角的变化可以获得分子间相互作用的信息。
b．方法：将重组的HIV－1整合酶偶联到芯片上，利用Biacore技术筛选化合物对整合酶的结合能力。化合物稀释到HBS－EP中配成25μg／ml，用含0．1％DMSO的HBS－EP 2倍倍比稀释，6个梯度，测定七对HIV－1整合酶的结合活性，结果用Blacore evaluation软件分析。
②DNA链转移活性检测法：选取两条同位素（上标32）P标记的互补寡居核苷酸链，先退火然后再待测化合物存在或不存在时，以电泳和放射自显影技术检测IN的3μ加工和DNA链转移活性，计算出化合物对IN活性的抑制程度和该待测化合物的Ki和EC（下标50）。
将受体DNA固定在酶标板上，加入工体DNA，重组的整合酶以及待测化合物，孵育一定时间后，洗去未整合的供体DNA，然后提取已整合DNA进行荧光定量PCR但应检测。检测整合酶将供体DNA整合到受体DNA上的能力是否受影响。
前整合复合体检测方法原理如下。
原理：HIV的前整合复合体（PIC）是大的核蛋白复合体，包括病毒的dRNA和IN以及宿主蛋白组分等。可从感染细胞中新鲜分离带有可以整合入靶DNA序列的病毒cDNA，检测化合物对PIC的抑制作用。
