用噬菌体、病毒作载体构建的重组子导入细胞的过程，这里所用的噬菌体DNA并没有包上它的外壳。基本原理是利用噬菌体的主动感染，将含有外源DNA片段的重组噬菌体DNA注入宿主菌体内，依照噬菌体的生活周期，重组噬菌体DNA就在宿主细胞中复制增殖。该方法不需制备感受态细胞和热休克处理，转染效率较高（约10（上标7）个转化子／μg DNA），常用于文库的构建。
3．转导
用噬菌体作载体所用的方法，这里所用的噬菌体DNA被包上了它的外壳，不过这外壳并不是在噬菌体感染过程中包上，而是在离体情况下包上的，所以称为离体包装。
4．注射
如果宿主是比较大的动植物细胞则可以用注射方法把重组DNA分子导入。
五、重组克隆的筛选、鉴定和分析
用以上任何一种方法连接起来的DNA中既可能包括所需要的DNA片段，也可能包括并不需要的片段，甚至包括互相连接起来的载体分子的聚合体，所以接受这些DNA的宿主细胞中间只有一小部分是真正含有所需要的基因的。基因克隆的最后一道工序是从大量受体菌中设法筛选出带有目的基因的重组菌（克隆株系），并进行鉴定重组子的正确性，培养克隆株系，提取出重组质粒，分离已经得到扩增的目的基因，再分析测定其基因顺序。一般通过几种方法可以筛选所需要的宿主细胞。
1．针对遗传表型的变化筛选
按载体的性状变化进行筛选。
（1）抗生素抗性转人获得对于带有抗药性基因的质粒来讲，从被转化细菌是否由敏感状态变为抗药的状态就可以知道它有没有获得这一抗药性质粒。转入载体的细胞能在含有相应药物的琼脂平板上生长成菌落，而未被转化的宿主细胞则不能生长。
（2）抗性的插入失活在含有两个抗药性基因的载体中，如果一段外源DNA片段插入其中一个基因导致其失活，就使获得这一质粒的细菌不再表现这种抗性。如把一个带有两个抗性基因氨苄青霉素抗性和四环素抗性的质粒pBR322用限制酶Bam HI处理，由于Bam H1的惟一的识别位点是在四环素抗性基因中，所以经同一种酶处理的DNA分子片段就可以连接在这一基因中间。在被转化的细菌中选择只对氨苄西林具有抗性而对四环素不具抗性的细菌，便可以获得带有外来DNA片段的载体的细菌。这是一种常用的遗传学方法。
（3）β－半乳糖苷酶系统许多克隆载体（如pUC、M13等）上都带有一个来自大肠杆菌DNA的短区段，其中含LacZ基因（编码β－半乳糖苷酶）的调控序列和β－半乳糖苷酶氪基端的146个氨基酸（α肽）的编码信息，在该编码区中插入了一个多克隆位点，不破坏读框，不影响功能。IPTG（异丙基－β－D－硫代半乳糖苷）可诱导该多肽的合成，同时该产物能与宿主细胞所编码的缺陷型半乳糖苷酶羧基端融为一体，形成具有酶活性的蛋白质，这样突变体1（缺失LacZ上近操纵基因区段）与突变体2（带有完整的近操纵基因区段而无β－半乳糖苷酶活性）之间的互补称为α－互补。由α－互补产生的Lac＋细菌易于识别，因为它可分解生色底物X－gal（5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D－半乳糖苷）而产生蓝色。然而，当外源DNA片段插入该载体的多克隆位点后，不可避免的会产生无α－互补能力的氨基端片段，使重组子所在细菌不能完成α－互补。因此，带有重组子的细菌形成白色菌落。
根据插入基因的遗传性状进行筛选。当已知所需克隆基因所编码蛋白质的功能，且该蛋白质为细菌的生命活动所必需时，即可用该方法筛选。如亮氨酸在基本培养基中为细菌的生命活动所必需，当外源目的基因为合成亮氨酸的基因时，将携带该基因的重组子转入Leu缺陷菌中，在仅含亮氨酸的基本培养基上筛选，只有能利用Leu的细菌才能生长，因而能生长的细菌均为重组子。
2．根据重组子的结构特征筛选
（1）快速裂解菌落，鉴定分子大小从平板上挑取菌落裂解后，不经内切酶消化，直接进行凝胶电泳，与载体DNA片段比较迁移率，初步判断是否有插入片段存在。本方法适用于插入片段较大的重组子的初步筛选。
（2）内切酶图谱鉴定对于初步筛选鉴定具有重组予的菌落，应小量培养后，在分离出重组质粒或重组噬菌体DNA，用相应的内切酶切割重组子，释放出插入片段。然后凝胶电泳检测插入片段和载体的大小。
（3）PcR筛选重组子利用能与插入片段两端互补的特异引物，以小量抽提的DNA进行PCR分析，能扩增出特异片段的转化子为目的重组子，PCR不但可迅速扩增插入片段，而且可直接进行DNA序列测定。该方法目前已得到广泛应用。
（4）核酸分子杂交该方法的基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下（适宜的温度及离子强度等），可按碱基互补配对原则退火形成双链，此杂交过程是高度特异性的。杂交的是待测的核酸序列和用于检测的已知核酸片段（称为探针）。将待测核酸变性后，用一定的方法将其周定在硝酸纤维膜（或尼龙膜）上，用经标记示踪的特异核酸探针与之杂交，该探针只能与互补的特异核酸牢固结合，而其他的非特异结合将被洗脱。根据待测核酸的来源以及将其分子结合到固相支持物的方法的不同，分为菌落印迹原位杂交、斑点印迹杂交、Southern印迹杂交和Northern印迹杂交四类。
各类杂交方法各有其实验目的和应用范围。菌落噬菌体印迹原位杂交可直接确定含有目的基因重组子的克隆，是从文库中筛选目的重组子的首选方法。斑点印迹杂交可确定提取的DNA或RNA样品中是否含有目的基因，如果有标准量参照，可对目的基因的拷贝数定量。Southern印迹杂交可确定提取的DNA中是否含有目的基因，可估计目的基因的大小，用于克隆基因的酶切图谱分析、基因组基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性片段多态性分析（RFLP）等。Northern印迹杂交可确定提取的RNA样品中是否含有目的基因的mRNA，可估计目的基因mRNA的大小。
（5）DNA序列测定克隆化的基因，特别是克隆经化学合成引物PCR扩增的基因，或对已知DNA序列进行了定点突变，都必须对其DNA序列进行测定。DNA序列测定技术，目前主要是依据Sanger等提出的酶法和Maxam和Gilber提出的化学降解法，这两种方法的原理大致相同。这里主要介绍sanger的酶法－双脱氧链终止法。
这一方法是利用2＇，3＇－双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）可以特异性地终止DNA链延长这一特点进行的。在DNA聚合酶的作用下，ddNTP的5＇三磷酸基团可以与正在合成的DNA链中的3＇羟基形成磷酸二酯键．当ddNTP掺入到正在合成的DNA链以后，由于3＇端是脱氧，不能再进行链延长反应，故该分子的链延长反应就此终止，由此即可进行DNA序列分析。
序列分析的原材料包括：待测序的DNA模板和一小段与模板链互补的DNA引物。将模板与引物退火后分成4个试管进行反应。每个试管中一种ddNTP（如ddATP）与其对应的dNTP（如dATP）按适当的比例混合，再加上其他三种dNTP（如dCTP，dGTP，dTTP）所用4种dNTP中有一种必须是同位素标记的，通常是α－（上标32）PdATP或α－（上标32）PdCTP，如此分成AGCT4个反应管，在DNA聚合酶作用下，正常的聚合作用即从引物处开始，若掺入的是ddNTP链延长即终止，若掺入的是dNTP则链继续延长，直至掺入另一ddATP。这样既可得到一系列标记的DNA链，其长度依赖于特定的ddNTP相对于引物末端的位置。将4个反应管加到聚丙烯凝胶上电泳，标记片段按大小分离，放射自显影后即按谱型读出DNA序列。
六、工程菌的获得和基因产物的分离
将目的基因克隆到表达载体上，再次导入到受体菌中，经反复筛选、鉴定和分析测定，最终获得较稳定的高产的基因工程菌，然后进行大量培养繁殖，产生出所需要的目的基因产物，再进行分离纯化。
七、基因表达
在构建重组体DNA分子和选择宿主细胞时，还须考虑外源基因表达的问题。就是说要求外来的基因在宿主细胞中能准确地转录和翻译，所产生的蛋白质在宿主细胞中不被分解，而且最好还能分泌到细胞外。为了使外源基因表达，需要在基因编码顺序的5’端有能被宿主细胞识别的启动基因顺序以及核糖体的结合顺序。两种常用的方法能用来使外源基因在宿主细胞中顺利地表达：①在形成重组体DNA分子时在载体的启动基因顺序和核糖体结合顺序后面的适当位置上连接外源基因。例如将兔的β－珠蛋白基因或人的成纤维细胞干扰素基因分别连接到已经处在载体上的大肠杆菌乳糖操纵子的启动基因后面，便能使它们在大肠杆菌中顺利地表达；②将外源基因插入到载体的结构基因中的适当位置上，转录和翻译的结果将产生一个融合蛋白。这种融合蛋白质被提纯后，还要准确地将两部分分开，才能获得所需要的蛋白质。在早期的遗传工程研究中，生长激素释放抑制因子和鼠胰岛素基因的表达都是通过将它们连接在β－半乳糖苷酶基因中的方式实现的。
