切片技术的应用到现在已有一百多年的历史了。最早应用的只是冰冻切片，随着冰冻切片的应用和实践又进一步利用石蜡的硬度，将要检查的组织块浸渍并包埋于这种坚实的介质之中，制成了石蜡切片。
切片技术随着生物学和医学的发展，经过不断地改进而逐渐完善起来，随着光学仪器和切片机器的日益的精密和不断向前发展。现代切片技术已成为生物形态学微观结构研究的一个重要方面，更是病理检验技术中不可缺少的一个组成部分。将各种组织制成菲薄的切片标本，需要经过一系列比较繁杂的过程，每一步都要求病理技术工作者认真、耐心、细致，整个过程一环扣住一环，才能获得良好结果。
制作切片的主要过程有：取材、固定、脱水、包埋、切片、染色、封固。在这7个主要过程中，又包括着若干步骤。
石蜡切片：取材→固定→冲水→脱水→透明→浸蜡→石蜡包埋→切片→染色→封固。
冰冻切片：取材→固定→冲水→冰冻切片→染色→封固。
一、取材
取材是制作切片程序中的首要步骤，取材不当，将直接影响病理诊断和科研工作的效果。组织标本的选用非常重要，不能随意的切取组织来制作组织切片，否则病理检验的结果是不会令人满意的。
（一）取材工具的选取
取材刀具必须锋利。切取标本不应该挤压和揉擦，不应使用有钩镊子或血管钳等镊取标本，以免损害组织造成人为组织变化，给诊断带来困难或导致错诊、漏诊。
（二）标本的选取
切取标本的原则是求准而小是求量多，所以切取组织宜小不宜大，以不超过2．4cm×2．4cm为佳，厚度以3—5mm为度，最厚勿超过5mm，过大过厚会影响对标本的固定，同时也影响切片的制作。如遇病变或可疑病变的组织，注意标本的取材。
（1）事先要做到对组织切片的结构清楚，取材要及时，组织块必须争取时间及时固定。组织的固定以愈新鲜愈好。
（2）取材时对大体标本绘制图像，进行仔细描述。包括形状、大小，硬度，颜色，病灶（或可疑病变）部位等。对所取的组织应定位编号，并认真检查有无遗漏。
（3）切取各组织块时，切勿挤压损伤，对典型或具有教学和科研价值的肉眼标本，不能因取材而对标本造成人为的“病变”。肠黏膜组织上粘有少量粪便，也不应以手拭去或以水洗去。
（4）取下的组织块应尽量防止弯曲扭转，如胃肠等组织，应先平展于滤纸上黏着以后，慢慢地放入固定液中。固定液的量要充足，应为固定组织的10倍。
（5）组织取材应在正常与病灶交界之处。组织形状最好为方形或长方形状，这样有利于制片。组织厚薄要均匀，因为组织块的厚度决定固定的速度，要充分满足它在一定时间内全部达到适宜的固定。如组织厚薄不均，在脱水时将会引起标本变形或扭曲，而影响制片。在典型病变部位不妨多切数块，以备日后教学或研究的需要。
（6）小标本和易碎标本，为避免破损或丢失应以包埋袋包裹，但包裹前包埋袋必须浸湿，以免标本黏附纱布上。
（7）各组织块应包括各脏器的重要结构，如肾脏，应包括皮质、髓质和肾盂；有包膜的器官如肝、肺、脾等应包括包膜在内；心脏、胃肠道等应包括全层结构。此外，各脏器每次取材的位置需统一，以便研究需要。
（8）组织内的钙化病灶或骨质，应在充分固定之后进行脱钙，组织内的非病理性异物和肌肉应予剔除。
（9）标本上附着的软组织如脂肪等，如属非病变戒分，则应在不影响病理诊断的原则下，尽量剥去或切除，以利制片。
（10）切取镜幢组织块后，可将剩余的组织放入甲醛（福尔马林）固定液中保存，归档。
二、组织的固定
（一）固定的意义
固定是指将各种组织浸入防腐剂内，使细胞内的物质为不溶性。固定的作用是用一种方法将组织尽可能保持在它原来的形态，且能适于某些研究程序。凡是需要制作病理标本的组织，首先必须固定。在制作切片过程中，固定是最为重要的步骤，一张优秀的组织学切片是建立在适当而完全的固定基础之上的。固定不良在以后制片的任何阶段皆不能补救。因此制片的优劣首先取决于最初固定适当与否。重要的是，被固定组织在动物死后或从活体切取后要尽可能立即固定。如果不迅速固定，造成固定不良，将导致染色不良后果。
（二）固定的目的和效果
固定组织的目的是设法得到接近正常生命状态的细胞结构。
1．抑制自溶和腐败
组织的固定能保持细胞与生活时的形态相似。因为当机体生命活动停止或局部组织割离机体之后，组织细胞的代谢功能即行丧失，新鲜组织如果不经固定，任意放置，由于细胞内酶对蛋白质的分解，以及细菌的滋生等各种因素的作用，则易因细菌繁殖而致组织腐烂。细胞内的蛋白质分解酶将蛋白质分解为氨基酸后脱离细胞而引起组织的自溶。
2．保存
细胞经过固定，能够沉淀或凝固组织内的各种成分和病理代谢产物，如蛋白质及脂蛋白、脂肪、糖类、色素、其他碳水化合物、微生物等都可以经过固定而保存下来，并在制片过程中不为其他试剂溶解破坏。
3．渗透和固定
固定还可以使组织和细胞的各种渗透压不再发生改变，在制片时就能在最大范围内保持组织和细胞的原来形态。
4．硬化
固定剂的硬化作用能使霆软组织（如脑）的质地变硬而易于操作。
5．胶质物体的固化
固定能使细胞正常的半液体状（溶胶）变为不能逆转的固体状（凝胶）黏度。
6．肉眼鉴别和对染色的影响
固定可将各种细胞和组织成分的折光率不同程度地改变，增强组织的折光指数，这样能使各种染色成分较之未周定时更容易辨认。
（三）固定的方法及注意事项
为使组织同定充分，应做到固定容器要合适、固定时间要充足，固定液量要足够。固定组织时应选择合适的容器，一般容器的容积是组织的10—15倍以上。标本瓶应选择瓶口较大的为宜，这样便于固定后的标本取出。如经小口瓶硬塞进去，不利于标本取出，还可能造成人为挤压组织而致形态变化。
组织固定的时间要足够，根据组织的种类、性质、大小、固定液种类以及渗透力的强弱而定，可从1～2h到几天不等，一般固定24h左右即可，大体标本一般固定需1周左右。在温箱内将固定液稍加温，可使固定作用加快而缩短固定时间。在固定期间轻轻振摇容器有利于固定液渗入并防止标本贴壁。
固定组织时应有足量的固定液，一般应为组织体积的5—10倍。标本最好悬浮于固定液之中。如标本块多时，固定时不应重叠。不要先将标本块放入容器后再注入固定液，以免标本贴付于器皿，形成固定不均匀之弊。一般实质性脏器制作标本时，其厚度宜在1．5cm左右。过厚则固定液不易渗透入内，过薄则易变形翘起。
特殊组织的固定方法各有不同，例如肺脏标本比重较轻，易漂浮在液面，可用薄层脱脂棉花覆盖其表面、借以棉花纤维的虹吸现象，可不断地浸湿标本。在有条件的情况下，为保证充分固定，应尽可能向标本内灌注固定剂。具有空腔的脏器（如大、小肠）、膜组织（如胸膜、腹膜等）、皮肤等则应在剪开后将其边沿钉在硬纸板上，标本朝下浸到固定液内，以保持病变的形态。囊腔组织如果没有打开可用注射器注入固定液使之充盈；如已打开则需填入浸有固定剂的脱脂棉以保持其自然状态。另外需要注意的是，如被胆汁污染或含胆汁的标本，必须分别固定贮存，否则会污染别的标本。对于某些需要制作神经染色和酶反应等组织的固定，要求较一般严格，组织的大小，固定的时间，温度的适当都应慎重考虑，尤其是对于酶反应的固定液，一般都要置于冰箱，在低温的条件下进行固定。
新鲜标本应及时固定，否则或因组织陈旧，或因固定不当，而使组织原有结构消失而影响观察。另外，固定液要避免接触阳光，以免引起化学变化，失去固定作用。
任何固定液对人体都有损害作用，因此固定渡的容器必须密闭，忌用手与固定剂直接接触，以免损伤皮肤。
（四）固定剂的选择
理想的固定剂应该具备下列几种特征。
（1）渗透性强固定剂必须能迅速渗入组织，这样组织内各种成分才能尽快地被固定在原位置，而不致弥散。
（2）组织固定后不应发生显著的收缩和膨胀现象实际上经过固定后的组织，由于蛋白质发生凝固或沉淀，必然导致组织出现不同程度的收缩或膨胀。因此，良好的固定剂应尽量减少组织发生这类变化。
（3）固定剂应该有利于组织切片和染色这其中含有两种意义：①固定剂对固定后的组织应有利于染色剂的染色。例如：重铬酸钾对于类脂质具有一定媒染作用；中性福尔马林比一般福尔马林所固定组织更优于核的染色。②固定剂能将组织或细胞中某些必须观察的成分充分固定而保存下来，以便染色。例如：酸可以渗入脂类物质使其固定下来而不至在制片过程中为乙醇和二甲苯溶解。糖原的证明，则宜使用非水溶性固定剂如无水乙醇、Camoy固定液等。
（4）固定液应该同时也是一种较好的保存液。
实际上，没有哪一种固定剂能够完全达到上述要求。各种固定剂性能和作用都不尽相同，因此，对标本的固定应根据组织的制片目的和要求去选择适当的固定剂。
（五）固定剂的种类
组织制片技术上所使用的固定剂种类繁多，性能各有不同，有的为氧化剂，有的为还原剂；有的呈酸性，有的呈碱性；有些易使组织收缩，有些则使组织发生轻微膨胀现象。一般地说，单一固定剂要想使组织固定后达到某种特殊染色要求是比较困难的。因此，在标本固定中常使用两种以上成分的混合固定液。
1．单一固定剂
仅由种化学物质加水溶解后用以固定标本的固定液叫单一固定液。常用单一固定液有甲醛、乙醇、冰醋酸、2，4，6一三硝基苯酚（苦味酸）、重铬酸钾、锇酸、氧化汞、丙酮等。除甲醛、乙醇和丙酮常用作单一固定剂外，其他多作混合液中的一种成分。这里只介绍甲醛和乙醇阿种常用的固定液。
（1）甲醛甲醛在常温下是气态，通常以水溶液形式出现。易溶下水和乙醇，35％—40％的甲醛水溶液叫做福尔马林。
甲醛是一种使用广泛、简便的固定剂，同时又是一种良好的标本保存液。经它固定的标本，可适应一些特殊染色。它的渗透性较强，固定均匀，能增加组织的韧性，组织收缩轻微，硬性大于乙醇。
甲醛长期贮存时，特别于寒冷气候下，自行分解，可变混浊，有白色沉淀物，这种沉淀即三聚甲醛，是甲醛的一种聚合形式（加热可重新分解成甲醛）。有时由于溶液不纯或甲醛氧化产生甲酸使溶液呈酸性，酸性的甲醛溶液使标本嗜染酸性，严重时可导致细胞核的嗜酸性染色。因此，在备用的甲醛中宜放入少量的碳酸镁或碳酸钠作为中和剂。欲使其长期保持中性，则需以磷酸缓冲液作溶剂进行配制。其配制方法如下：10％甲醛1000ml，磷酸二氢钠4g，磷酸氢二钠6．5g。
固定小的组织块数小时即可达到固定要求。如需要快速固定时，可加温到70～80℃，经过10mm即可达到固定要求。在甲醛溶液中短时固定的标本，冲洗时间在10min—2h即可，但固定时间较长的标本需要较长时间的流水冲洗。一般要冲洗24h，甚至48h，否则会影响染色的结果。缓冲甲醛固定剂具有能较好地保存细胞结构和某些细微结构，适于免疫组织化学染色和电镜观察，并可长时间保存组织而又不影响制片和染色。是近几年越来越受到重视的固定剂。
另外需要说明的是，甲醛固定的标本，经乙醇脱水收缩较大，是其缺点。
（2）乙醇乙醇为无色液体，可与水在任何比例下混合。它是一种还原剂，所以不可与铬酸、重铬酸钾或锇酸等氧化剂相混合使用。乙醇为常用的有机溶剂，能溶解多种有机物，高浓度乙醇能凝固白蛋白、球蛋白和核蛋白，对肝糖原有固定作用，核蛋白和肝糖原经乙醇固定成水溶性状态，因此，经乙醇固定的标本如果固定后用水洗涤，则核着色欠佳，肝糖原也将被水解。作为一种脂溶剂，浓度在50％以上的乙醇可溶解脂肪和类酯体，因此，对脂类的证明、高尔基体、线粒体等染色不宜使用乙醇作固定剂。
高浓度乙醇固定的组织收缩显著，它的穿透力缓慢且与组织长期接触能使之硬化。组织必须用乙醇固定时宜先用80％的乙醇固定数小时，然后再换95％乙醇，这样可以避免组织过度收缩，如需要证明尿酸结晶和保存糖类，则需用100％乙醇固定。
乙醇既有同定作用，又有脱水作用，经乙醇固定的标本不需洗涤，可用较高浓度乙醇直接进行脱水，也可暂存于70％乙醇中。
2．混合固定液
（1）Bouin固定液配方：苦味酸饱和水溶液75ml，福尔马林25ml，冰醋酸5ml。
此固定液保存性良好，渗透速度快，穿透力迅速而均匀，且很少引起收缩，不使组织变硬和变脆，固定后的组织用三色染色法着色鲜艳绚丽，过量苦味酸使组织呈黄色，但并不妨碍染色，无需洗净除去。此液也是皮肤组织较好的固定液，它可以软化表皮不使其变硬变脆，利于切片，对蛋白质、核酸有较好的固定作用，一般固定时间为数小时至一日。
（2）醋酸一乙醇一福尔马林混合同定液配方：幅尔马林10ml，冰醋酸5ml，70％乙醇85m1。
这种混合固定液通常简称AAF固定液。使用较广泛，配制时一般以乙醇作为溶剂，加入福尔马林和醋酸。乙醇可因组织种类不同而采用不同的浓度，在常规切片中。常采用浓度为95％乙醇。此液对糖原的固定较好，其缺点是组织固定后对细胞膜上和细胞内的某些结构有一定破坏作用，而对免疫组织化学染色有定影响。
三、脱钙
骨组织及钙化病灶，必先将钙盐除去使组织软化，才能进行常规切片。如脱钙不全则切片易撕开或碎裂并损伤切片刀刃。脱去钙盐的过程称为脱钙。
脱钙时应注意：
（1）骨组织固定24h后，锯F不超过0．5mm厚的薄骨片，再以10％甲醛固定后进行脱钙。骨组织过厚则需延长脱钙时间，而长时间浸于强酸影响切片染色效果。
（2）在不影响诊断的条件下，应将骨组织周围的软组织全部剥去。如果切片目的在于观察骨髓病变或骨组织肿痛，最好除去一部分正常的致密的骨组织，以利于脱钙和制片。
（3）脱钙前最好先将骨组织进行脱脂。
（4）脱钙要彻底，脱水应充分，在脱水过程中，要注意不使其过度硬化。
优质脱钙剂的标准屉：完全脱钙；不损伤组织细胞或纤维；不妨碍以后的染色技术；有适当的脱钙速度。
（一）强酸脱钙剂
1．含甲酸脱钙液
Gooding和Stewert液（甲酸—福尔马林液）：配方为甲酸5—25ml，福尔马林5ml，蒸馏水加至100ml。
