内毒素浓度（EU／ml）0．25 0．125 0．0625 0．031 Nc反应终点浓度X
1++---0．125
2+----0．25
重复管数3+++-0．0625
4+++-0．625
_________________________________________________________________________
λc=lg的-1次方（ΣX／4）=lg的-1次方[（lg0．125+lg0．25+lg0．0625+lg0．0625）／4]=0．105（EU／ml）
λc在0．5λ～2．Oλ范围内，符合规定。并且该批鲎试剂的灵敏度为标示灵敏度O．125EU／ml。
（二）光度测定法标准曲线的可靠性实验
当使用新批号的鲎试剂或实验条件发生了任何可能会影响检验结果的改变时，需进行标准曲线的可靠性实验。
实验步骤：
（1）细菌内毒素标准曲线溶液的制备按照细菌内毒素标准曲线溶液的制备标准系列溶液。
（2）鲎试剂的准备要求内毒素标准系列中每一浓度至少做3支平行管，并要求同时做2支阴性对照。根据所制备的标准曲线中浓度的个数来计算所需要的鲎试剂体积。按照光度测定法鲎试剂准备方法准备鲎试剂。
（3）加样将标准内毒素溶液和阴性对照按仪器要求的体积分装到仪器配置的反应容器中，如小试管或微孔板。再加入要求体积的鲎试剂，轻轻混匀，避免产生气泡，然后将反应容器放入光度测定仪中进行反应。
（4）结果判断当阴性对照的反应时间大于标准曲线最低浓度的反应时间，将全部数据进行线性回归分析。根据线性回归分析，标准曲线的相关系数（r）的绝对值应大于或等于O．980。实验方为有效。否则需重新实验。
五、供试品的预处理
供试品的预处理包括供试品的限值的确定、供试品最大有效稀释倍数的确定与供试品干扰实验。药典中已有规定的品种或有其他内毒素检验标准的品种，可直接进行内毒素检查，如在检验中出现干扰的情况需再进行干扰实验的验证；其他未建立内毒素检查的品种需先进行干扰实验，确定不干扰浓度后再进行内毒素检查。有些供试品还需要特殊处理。
（一）供试品细菌内毒素限值的确定
（1）药典中有规定的，按供试品各论中规定限值。
（2）若尚无标准规定的，按以下公式确定供试品内毒素限值。
L=K／M
式中，L为供试品的细菌内毒素限值，以EU／ml、Eu／mg、EU／u、EU／剂等表示；K为按规定的给药途径，人用每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU／（kg·h）表示。其中注射剂，K=5EU／（kg·h）；放射性药品注射剂，K=2．5EU／（Kg·h）；鞘内用药品，K=0．2EU／（kg·h）。M为人用每千克体重每小时最大剂量，以ml／（kg·h）、mg／（kg·h）、u／（kg·h）等表示。药品人用最大剂量可参阅《中华人民共和国药典临床用药须知》，中国人均体重按60kg计算，注射时间小于1h的按1h计。若供试品按体表面积给药，则M=[最大给药剂量（m的平方／h）×1．62（m的平方）]／60kg
（二）供试品最大有效稀释倍数的确定
供试品的最大有效稀释倍数（MVD）按下武计算：
MVD=C·L／λ
式中，L为供试品的细菌内毒素限值，主要以EU／ml，Eu／mg、EU／U、EU／剂表示。当L以EU／ml表示时，C等于1．0ml／ml；当L的单位以EU／mg、EU／U或EU／剂表示时，C为供试品制备成溶液后的浓度，单位为mg／ml或U／ML或剂／ml。
λ在凝胶法中为鲎试剂的标示灵敏度，在光度测定法中为所使用的标准曲线中的最低内毒素浓度。
（三）供试品的特殊处理
某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。一般要求供试品洛液的pH在6．0—8．0的范围内。对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液（或其稀释液）的pH，可使用酸、碱溶液或适宜的缓冲液调节pH。馥或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。
（四）供试品溶液的干扰实验
药典中已有规定的品种或有其他内毒素检验标准的品种，可直接进行内毒素检查，如在检验中出现干扰的情况需再进行干扰实验的验证；其他未建立内毒素检查的品种需先进行干扰实验，确定不干扰浓度后再进行内毒素检查。
干扰实验的月的是确定供试品在多大的稀释倍数或浓度下对内毒素和鲎试剂的反应不存在干扰作用，为能镡使用细菌内毒素检查法提供依据。并且验证当供试品的配方和工艺有变化，鲎试剂来源改变或供试品阳性对照结果呈阴性时供试品是否存在干扰作用。
由于干扰实验检验的是在供试品存在的情况下内毒素与鲎试剂的反应是否正常，与所使用鲎试剂的灵敏度无关，因此在于扰实验中原则上可使用任一灵敏度的鲎试剂。但建议使用较低灵敏度（如0．5或0．25EU／ml）的鲎试剂，可尽量避免供试品所含的内毒素对干扰实验造成的阳性影响。
进行干扰实验时，标准对照系列和含内毒素的供试品溶液系列应同时进行。
1．凝胶法干扰实验预实验
预实验的目的是初步确定供试品的最大不干扰浓度（当限值EU／mg或EU／U活性等单位表示）或最小不干扰稀释倍数（当限值以EU／ml表示），为正式干扰实验提供依据。
实验步骤：
（1）将无可检测到内毒素的供试品进行一系列倍数的稀释，但最大的稀释倍数不得超过MVD=C·L／λ0．03EU／ml为现今我国市售鲎试剂的最高灵敏度）。
（2）使用鲎试剂对每一稀释倍数进行检验。每一稀释倍数下做2支供试品管和2支供试品阳性对照（即用该浓度的供试品稀释渡将内毒素标准品制成2．0λ浓度）。另取2支加入细菌内毒素检查用水作为阴性对照，2支加入2．0λ浓度的内毒素标准溶液作为阳性对照。
（3）观察并记录结果。
（4）结果判断。当阴性对照为阴性，阳性对照为阳性时，实验为有效。当系列浓度中出现供试品溶液2管为阴性，供试品阳性对照2管为阳性时，认为供试品在该浓度下不干扰实验，此稀释倍数即为最小不干扰稀释倍数。即可选择该稀释倍数进行正式干扰实验。
当系列浓度中所有浓度的供试品管都不为阴性，或供试品阳性对照管不为阳性时，说明供试品对内毒素与鲎试剂的反应存在干扰，则应对供试品进行更大倍数稀释（不得超过MVD=c·L／0．03λ），或通过其他适窟的方法（如过滤、中和、透析或加热处理等）排除干扰。
当供试品的内毒素限值单位为EU／mg或EU／U活性单位时，应将最小不干扰稀释倍数换算成最大不干扰浓度（即该稀释倍数下溶液的浓度），以mg／ml或活性单位／ml表示。
（5）举例设某注射液限值为2．5EU／ml，按MVD=c·L／λ计算出灵敏度为0．03EU／ml下的MVD为83倍，将供试品溶液稀释一系列检验，用是敏度为0．25EU／ml的鲎试剂进行预实验。结果如下：
______________________________________________________________________
稀释倍数原液5 10 20 40 80
_____________________________________________________________________
供试品溶液------------
供试品阳性对照------++++++
______________________________________________________________________
如上结果可初步确定该样品的最小不干扰稀释倍数为20倍，可在此浓度下进行正式干扰实验。
2．凝胶法正式干扰实验
目的是检验在某一浓度下的供斌品对于黉试剂与内毒素的反应有无干扰作用。
（1）制备内毒素标准溶液按照制备内毒素标准溶液方法制备4个浓度的标准溶液即2．0λ、1．Oλ、0．5λ、0．25λ。
（2）制备含内毒素的供试品溶液制备由预实验中确定的不干扰稀释倍数下含4个浓度即2．0λ、1．Oλ、0．5λ、0．25λ的标准内毒素的供试品溶液。
以注射用头孢哌酮钠（1g／瓶）为例：取10ml检查用水溶解注射用头孢哌酮钠即为100mg／ml，用内毒素检查用水将其稀释20倍（即5mg／ml）后备用。（注：冻干品或无菌粉末检查用水溶解后体积有无变化，根据具体情况定。）
取1支细菌内毒素标准品，加入1ml细菌内毒素检查用水溶解，混匀后使用5mg／ml头孢哌酮钠溶液作为溶剂将细菌内毒素标准品依次稀释至2．0λ、1．0λ、0．5λ和0．25λ四个浓度。
或按照样品阳性对照液的制各方法：分别用0．5ml浓度为2．0λ、l．0λ和0．5λ的内毒素标准溶液制备含1．0λ、0．5λ和0．25λ内毒素的浓度为5mg／ml的供试品阳性对照溶液。（其体积的大小视情况而定）。
（3）鲎试剂的准备按鲎试剂的准备方法准备鲎试剂36支，备用。
（4）加样将准备好的黉试剂取其中18支（管）放在试管架上，排成5列，4列4支（管），1列2支（管）。其中的4支4列每列每支分别加入0．1ml的2．0λ、l．Oλ、0．5λ、0．25λ的内毒素标准溶液，另一列2支（管）加入0．1ml检查用水作为阴性对照。
将另外18支（管）鲎试剂放在试管架上，排成5列，4列4支（管），1列2支（管）。其中的4支4列每列每支分别加入O．1ml含2．0λ、1．0λ、0．5λ、0．25λ的内毒素的供试品溶液．另一列2支（管）加入0．1ml供试品溶液作为样品阴性对照。
加样结束后，按照要求孵育。观察并记录结果。
（5）结果计算如两组最大浓度2．0λ均为阳性，最低浓度0．25λ均为阴性，阴性对照4管均为阴性时，按下式计算用检查用水制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值（Es）和用供试品溶液或稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的几何平均值（Et）。
Es=lg的-1次方（ΣX5／4）
E1=lg的-1次方（ΣX1／4）
式中X8、X1分别为检查用水和供试品溶液或稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的对数值（lg）。
（6）结果判断当Es在0．5λ～2．0λ（包括0．5λ和2．0λ）时。且E1在0．5E8～2．0Es．（包括0．5Es和2．0Es）时，则认为供试品在该浓度下不干扰实验，可在该浓度下对此供试品进行细菌内毒素检查。
当E1不在0．5Ea—2．0Es（包括0．5Ea和2．0Es）时，则认为供试品在该浓度下干扰实验。应使用适宜方法排除干扰，如对供试品进行更大倍数的稀释，是排除干扰因素的简单有效方法。建立新品种细菌内毒素检查方法时，每个厂家至步取3个批号（不包括亚批）的供试品，用两个以上鲎试剂生产厂家的鲎试剂进行干扰实验。
