一、概述
急性毒性实验（acute toxicity test），研究动物一次或24h内多次给予受试物后，一定时间内所产生的毒性反应和死亡情况。仔细观察动物是否出现耸毛、蜷卧、耳鞘充血、突眼、步履蹒跚、肌肉瘫痪、呼吸困难、昏迷、惊厥、大小便失禁、死亡等反应。
急性毒性实验处在药物毒理研究的早期阶段，对阐明药物的毒性作用和了解其毒性靶器官具有重要意义。当受试物在无其他参考资料的情况下，急性毒性实验所获得的信息对长期毒性实验、特殊毒性实验剂量的设计和某些药物Ⅰ期临床实验起始剂量的选择具有重要参考价值，并能提供一些与人类药物过量急性中毒相关的信息。
二、实验要求
1．受试物
应采用工艺稳定的制剂，若给药容积受限，也可采用原料药。应注明受试物的名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件、配制方法等。
2．动物
啮齿类动物和非啮齿类动物，常用动物有小鼠、大鼠、犬、兔等。通常采用两种性别动物，雌雄各半。若采用单性别进行实验，应注明理由。一般选用健康成年的动物，并具有实验动物质量合格证。
3．给药途径
有经口给药、注射给药（若为静脉注射应注意给药速度）、皮肤等给药途径，给药途径不同，受试物的吸收速度、吸收率和暴露量会有所不同，因此需要采用不同给药途径进行实验。经口给药的动物一般应进行一定时间的禁食，不禁水。因为胃内容物会影响受试物的给药容量，而啮齿类动物禁食时间的长短会影响药物代谢酶的活性和受试物肠道吸收，从而影响毒性的暴露。
4．给药剂量水平
重点观察动物出现的毒性反应，可选择适当的方法进行研究，对于非啮齿动物给予出现明显毒性的剂量即可，没有必要达到致死水平。
5．观察时间及指标
给药后一般连续观察至少14天，观察的间隔和频率应适当，以便能观察到毒性反应出现及恢复的时间、动物死亡时间等。观察的指标包括一般指标（如动物外观、行为、对刺激的反应、分泌物、排泄物等）、动物死亡情况（死亡时间、濒死前反应等）、动物体重变化（给药前、实验结束处死动物前各称重一次，观察期间可多次称重）等。记录所有的死亡情况、出现的症状以及症状起始时间、严重程度、持续时间等。
6．病理检查
所有的实验动物均应进行大体解剖，包括实验过程中因濒死而处死的动物以及实验结束时仍存活的动物。任何组织器官出现体积、颜色、质地等改变时，均应记录并进行组织病理学检查。
7．实验条件
实验室温度、湿度、光照、饲养、卫生等应符合国家标准。
8．急性毒性测定方法
半数致死量（LD（下标50）），最大给药量，最大耐受量。
三、实验方法
（一）半数致死量测定
半数致死量测定法是一种经典的急性毒性实验方法，是指能够引起半数动物死亡的剂量，即药物致死量对数值，用符号LD（下标50）表示。
在理论上对数最小致死量呈正态分布，曲线横坐标上的均数两侧，动物数（频数）各占一半，所以出现频数最高的均数就是LD（下标50）的对数值。如果将相对频数转化为累积频率，则得到对称的S形累积分布曲线，对称的中心点在死亡率50％处，所相当的剂量即横坐标上对数最小致死量的均数，而且S形曲线上对称点处的斜率最大，当剂量有所增减时，死亡率的变化最明显。
LD（下标50）测定方法主要有Bliss法、改进寇氏法、简化机率单位法。
下面以改进寇氏法为例介绍LD（下标50）测定方法
1．改进寇氏法
（1）预实验找出0％和100％估计致死剂量（D（下标n），D（下标m）），预实验一般采用少量动物进行，将动物随机分为3～4组，每组动物4只小鼠，用2～10倍稀释的系列药液，以0．2ml／kg容量给药，根据小鼠死亡情况，找出D（下标n）及D（下标m）进行正式实验。
（2）正式实验在预实验D（下标n）和D（下标m）剂量范围内设4～6个剂量组。最理想的结果是使LD（下标50）上下各有2～3组。组数愈少，准确性愈差。各剂量组动物数量要求相等，至少10只动物（分组时注意随机均匀的原则）。组间剂量比值（1：k）常用1：（0．7～1）：0．85。如实验中出现相邻剂量有重复的100％和0％反应率时，应将靠边的组弃去不计，使大剂量组只有一个100％的反应率，小剂量组也只有一个0％的反应率（表4－1）。
表4－1选择分组及剂量比值简表
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剂量比值0．6 0．65 0．7 0．75 0．8 0．85 0．88 0．9
（1：k）＝
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最高最低2倍左右－－－3～4组4组5～6组6～7组7～8组
致死量相3倍左右－3～4组4组4～5组5组6～8组9组－
差的倍数4倍左右3～4组4～5组5组5～6组7～8组9组－－
（D（下标m）／D（下标n））6倍左右4～5组5～6组6组7～8组9组10组－－
10倍左右5～6组6～7组8组9～10组10组－－－
14倍左右6～7组7组8～9组10组
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分组完毕和各剂量算出后，分别给不同剂量的受试物。为能得到理想的结果，实验最好从中间剂量开始，以便从最初几个剂量组动物接受药物后的反应来判断两端剂量是否合适，便于调整剂量和组数。为了提高实验的精确度和节省药物，受试药物可按倍比稀释法配置，即每只动物的用药体积相等（0．2ml／10g）。给药后每日观察并记录中毒反应、死亡数和死亡情况。
实验完毕记录各组死亡动物数，算出死亡率（P），按改进寇氏法进行计算。
LD（下标50）＝lg（上标－1）［X（下标m）－i（∑P－0．5）］（g／kg）
式中：X（下标m）为最大剂量组剂量的对数值；i为相邻两组剂量（d）对数值之差，即：lgd（下标3）－lgd（下标2）＝lgd（下标2）－lgd（下标1），或相邻两组高剂量与低剂量之比的对数；P为各组动物的死亡率，用小数表示（如死亡率为100％应写成1．0）；∑P为各组动物死亡率的总和；N为每组动物数；Sx（下标50）为lgLD（下标50）的标准误，x（下标50）＝lgLD（下标50）。
LD（下标50）的标准误（Sx（下标50））计算公式如下：
Sx（下标50）＝i×［（∑P－∑P（上标2））／（n－1）］（上标1／2）
LD（下标50）的95％可信限＝lg－1（x（下标50）±1．96Sx（下标50））
LD（下标50）的平均可信限＝LD（下标50）±（LD（下标50）高限－LD（下标50）低限）／2
2．两药LD（下标50）值的比较
比较两药LD（下标50）值的差异有无显著性意义，可用两药的lgLD（下标50）及其标准误（Sx（下标50））进行t－检验。为此，先计算t值：
t＝［|lg（LD（下标50））（下标1）－lg（LD（下标50））（下标2）|］／｛［（Sx（下标50））（下标1）］（上标2）＋［（Sx（下标50））（下标2）］（上标2）｝（上标1／2）
式中lg（LD（下标50））（下标1）、lg（LD（下标50））（下标2）和（Sx（下标50））（下标1）、（Sx（下标50））（下标2）分别代表两药的半数致死量的对数及其相应的标准误。然后用自由度为df＝n（下标1）＋n（下标2）－4，显著性水平为0．05和0．01的t的临界t（下标0．05）和t（下标0．01）值作最后判断，若t＞t（下标0．05）则判定有显著意义；若t＞t（下标0．01）则判定有极显著意义，若t＜t（下标0．05），则判定无显著意义。在计算出LD（下标50）的95％可信限（L（下标95））后，也可用以下近似值计算LD（下标50）对数的标准误：
Sx（下标50）＝L（下标95）／4．5LD（下标50）
（二）近似致死剂量法
该方法主要用于非啮齿类动物实验。一般采用6只健康的Beagle犬或猴。犬龄为4～6月，猴为2～3岁。根据小动物实验结果、受试物的化学结构和其他有关资料估计可能引起毒性和死亡的剂量范围。按50％递增法，设计出含数个剂量的剂量序列表。由剂量序列表中找出可能的致死剂量范围，每间隔一个剂量给一只动物，测出最低致死剂量和最高非致死剂量，然后用二者之间的剂量给一只动物。如果该剂量下动物未发生死亡，则该剂量与最低致死剂量之间的范围为近似致死剂量范围；如果该剂量下动物死亡，则该剂量与最高非致死剂量间的范围为近似致死剂量范围。
（三）最大给药量法
对于某些低毒的受试物可采用此法，在合理的最大给药浓度及给药容量的前提下，以允许的最大剂量单次给药或24h内多次给药（剂量一般不超过5g／kg体重），观察动物出现的反应。一般使用10～20只动物，连续观察14天。
（四）固定剂量法
该方法不以死亡作为观察终点，而是以明显的毒性体征作为终点进行评价。选择5、50、500、2000mg／kg 4个固定剂量进行实验，特殊情况下可以增加5000mg／kg剂量。实验动物首选大鼠，实验前禁食6～12h，给受试物后再禁食3～4h。采用一次给药的方式进行。如无资料证明雄性动物更敏感，首先用雌性动物进行预试。根据受试物的有关资料，从上述4个剂量中选择一个作为初始剂量；若无有关资料可作参考时，可用500mg／kg初始剂量进行预试，如无毒性反应，则用2000mg／kg进行预试，此剂量如无死亡发生即可结束预试。如初始剂量出现严重的毒性反应，应降低一个档次的剂量进行。如动物存活，在此两个固定剂量选择一个中间剂量进行实验。每个剂量组给一只动物，预试一般不超过5只动物。每个剂量组实验之间至少应间隔24h。给受试物后的观察期至少7天，如动物的毒性反应到第7天仍然存在，应继续观察7天。在上述预试的基础上进行正式实验，每个剂量至少用10只动物，雌雄各半。根据预试结果，在上述4种剂量中选择一个可能产生明显毒性但又不引起死亡的剂量进行实验，如预实验结果表明，5．0mg／kg引起死亡，则降低一个剂量档次进行实验。
给受试物后至少应观察2周，根据毒性反应的具体特点可适当延长。对每只动物均应仔细观察并详细记录各种毒性反应出现和消失的时间。给受试物当天至少应观察记录两次，以后可每天一次，记录观察的内容包括皮肤、黏膜、毛色、眼睛、呼吸、循环、自主活动及中枢神经系统行为表现等。动物死亡时间的记录要准确。给予受试物前、后各1周、动物死亡及实验结束时应称取动物的体重。所有动物包括死亡或处死的动物均应进行尸检，尸检异常的器官应进行病理组织学检查。固定剂量实验法所获得的结果，参考表4—2标准进行评价。
表4－2固定剂量法实验结果评价
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剂量实验结果
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（mg／kg）存活数＜100％100％存活毒性表现明显100％存活无明显中毒表现
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5高毒有毒用50mg／kg实验
（LD（下标50）≤25mg／kg）（LD（下标50）＞25～200mg／kg）
50有毒或高毒，用5mg／kg实验有害用500mg／kg实验
（LD（下标50）＞200～2000mg／kg）
500有毒或有害，用50mg／kg（LD（下标50）＞2000mg／kg）用2000mg／kg实验
实验
2000用500mg／kg实验该化合物无严重急性中毒的危险性
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（五）累计剂量设计法（金字塔法，pyramiding dosage design）
在非啮齿类动物进行急性毒性实验可采用此方法。经典的实验设计需要8只动物，分对照组和给药组，每组4只动物，雌雄各2只。
剂量的设计可以是1、3、10、30、100、300、1000、3000mg／kg，也可以采用10、20、40、80、160、320、640、1280mg／kg，通常隔日给予下一个高剂量，剂量逐渐加大，直到出现动物死亡时或达到剂量上限时为止。
当没有动物死亡时，MLD（最小致死剂量）和LD（下标50）大于最高剂量或受限剂量。当在某一剂量，所有动物均出现死亡时，MLD和LD（下标50）应在最后两个剂量之间。当某一剂量部分动物出现死亡，部分死亡出现在后继的下一个高剂量，此时，MLD位于首次出现死亡的剂量和前一低剂量之间，LD（下标50）则应在首次出现动物死亡的剂量和所有动物均死亡的剂量之间。假如没有动物死亡发生，常常以高剂量给予动物5～7天，以确定后续的重复给药实验中高剂量的选择。
