1985年Chisari等和Babinct领导的两个研究小组最早采用受精卵显微注射法，建立起HBV转基因小鼠。是将事先经纯化、修饰等手段处理过的整个HBV基因组或其中某一片段注入小鼠单细胞受精卵的雄原核，再植入假孕母体，足月后产出的小鼠经鉴定若能复制、转录和表达HBV基因，待成年后，便可与遗传背景相同的正常鼠交配建立纯系，其子代中那些能复制，转录和表达HBV基因的小鼠，即可为供研究用的HBV转基因小鼠。这种转基因小鼠模型血清中可测出高滴度的HBsAg、前S1、HBeAG，也能产生抗HBs。肝细胞有抗HBcAg表达，PCR检测能够显示血清HBV－DNA升高。肝细胞出现毛玻璃样的改变，内质网肿胀、功能失调，在高水平表达HBsAg大蛋白的大鼠可见肝细胞灶样坏死和炎症。目前已在抗HBV药物筛选中应用。国内已有使用苦参素对转基因小鼠的肝脏组织进行HBsAg和HBcAg的研究，但是这种动物模型的制备技术要求高，设备昂贵，并且同人乙型肝炎的复杂表现尚有很大的差异。如能通过应用HBV感染相关的人肝细胞膜受体基因制备转基因小鼠，以期HBV受体在小鼠肝细胞表达，再接种HBV，则可望获得理想的小鼠乙型肝炎模型，仍是今后研究的方向。
5．HBV转染小鼠模型
1999年，Liu等给小鼠尾静脉短时间注射含目的基因的生理氯化钠溶液后，在其肝脏中检测到基因表达产物，这种技术即为水动力转染技术（hydrodynamicsbased transfection）。该技术简单、方便，是高教的体内转染方法。其要点是高压下在小鼠尾静脉内快速（＜5s）注射大体积含目的基因的生理氯化钠溶液，约占小鼠体重的8％～12％。水动力转染的目的基因在肝脏中的表达水平通常较其他器官高10的2次方～10的3次方，适于建立肝炎病毒的小鼠模型。目前应用水动力转染技术已成功建立了急性乙型肝炎病毒小鼠复制模型。Yang等研究发现，将1．3倍HBV基因组和睡美人转座子pCMV－SB质粒利用水动力转染技术通过小鼠尾静脉注射到体内，病毒抗原在24h内到高峰，7日后随抗体的出现病毒抗原消失。同时，将目的基因转染到缺乏B、T和NK细胞的NOD／SCID小鼠体内，病毒持续表达81日。2006年Gilad等将HBV adw亚型通过酶切位点连接到载体pGEM－7，利用水动力转染法通过尾静脉分别注射到BALB／c和SCID小鼠体内。在BAIB／c小鼠体内HBeAg和HBsAg在第3天达到高峰，10日后随着抗体的出现开始下降；在SCID小鼠血清中30日后仍然可以检测到HBeAg和HBsAg，利用Real－Time PCR检测到HBV－DNA的复制水平可以达到10的6次方～10的7次方倍。同年日本研究者发现，利用水动力转染技术注射1．5倍HBV基因到BALB／c裸鼠体内，HBV相关抗原的表达超过1年，同时利用PCR技术在小鼠肝脏内检测到了cccDNA。水动力转染技术的缺点是目的基因多瞬时表达。
6．V感染的人鼠嵌合肝脏小鼠模型
嵌合小鼠肝脏模型就是把正常人的肝细胞移植到免疫缺陷的小鼠体内产生免疫耐受，建立人鼠嵌台肝脏，后用高滴度的HBV阳性血清感染小鼠，建立HBV感染的人鼠嵌合肝脏小鼠模型，在肝脏和外周血清中均可以发现HBV感染的检测指标。HBV在嵌台肝脏中可以复制，可以模拟HBV复制的全过程；可以用来抗HBV病毒治疗和细胞受体的研究；人的肝脏细胞移植到小鼠体内有助于了解肝脏再生和细胞分化。但是HBV感染的人鼠嵌台肝脏小鼠模型存在着很大的局限性，如人肝脏细胞供体来源有限、移植技术难度较大、操作复杂及移植成功率低、费用昂贵等。由于受体小鼠缺乏完整的免疫系统，难以观察到免疫系统与病毒抗原相互作用而引起乙型肝炎发展的全过程。人肝细胞异种移植建立的人鼠嵌合肝动物模型的实用性和有效性需要进一步进行验证。
三、抗乙型肝炎病毒药物的筛选方法
乙型肝炎病毒对人有感染性，HBV阳性血清含有病毒，HBV转染细胞2215细胞分泌病毒，实验者无e、s抗体者需预先免疫，病毒和感染器皿需消毒后再行处理。
（一）乙型肝炎病毒模型
1．体外细胞培养实验
以转染HepG2．2．15细胞为例。
（1）病毒与细胞HBV转染HepG2 2215细胞株。
重组载体pDOL T2HBV21（含2个HBV头对尾二聚体，以尾对尾方向串联）转染HePG2细胞，经G418筛选，获得一个产生高水平HBeAg及HBsAg的细胞克隆，称之为2．2．15细胞。这种细胞培养上清液中可检测到病毒DNA，HB2sAg浓度可达412～9412g／L，免疫电镜22nm球形和杆状HBsAg样颗粒及42nm Dane样颗粒。该细胞株已用于抗病毒药物评价等的研究。如反基因寡核苷酸（ODNa121）和反义寡核酸（ODN as21）在体外能有效抑制HBV复制及抗原合成。它的优点在于病毒复制可持续很长时间，且可传代培养维持达1年。但该细胞株表达不稳定，随着传代次数的增加主要抗原表达量逐渐降低。
（2）阳性对照药物阿糖腺苷单磷酸（Ara－AMP）或无环鸟苷（ACV）或磷甲酸（PFA）。
（3）病毒动态测定2215细胞培养3，5，7，10，14天收取上清液，测定HBsAg，HBeAg，计算P／N值。收取细胞提取总核酸，采用PCR方法（聚合酶链反应法）结合HBV－DNA荧光探针作核酸杂交的体外扩增和检测技求测定HBV－DNA的含量。
（4）计算TID50。
（5）药物毒性测定
①药物以10倍稀释不同浓度药液加于2215细胞单层培养板上，以细胞病变和中性红染色，测定TCD0和TCD50。
②使用SRB（Suforhodamine B，磺基罗丹明B）细胞染色技术测定药物对细胞的毒性。用SRB显色法测定药物对细胞的毒性。具体方法是：将HePG2．2．15细胞按1×10的5次方个／ml接种于96孔细胞培养板，每孔200ul，依次将中药提取物、对照药物各组分药物（相当于800、400、200、100ug／ml共4种浓度）加人培养板中，每3天换相同浓度的同种药液和新鲜培养液，设不加药物的10％DMSO为对照孔，于第6天吸去上清液，每孔加入50％的三氯乙酸（TCA）50ul固定细胞，然后放入4℃冰箱中放置30min，每孔加入去离子水洗涤5次，在空气中干燥后每孔加入0．4％SRB染色剂100ul染色30min，弃去各孔液体后用1％醋酸清洗4次，晾干，加入10mmol／L Tris缓冲液（pH＝10．200ul／孔）在平板振荡器上溶解5min。用自动酶标仪于吸收波长515nm条件下检测其吸光度（A）。按下列公式计算细胞存活率。
细胞存活率（％）＝（实验孔A值／对照孔A值）×100％
50％毒性浓度（TC50）是实验孔存活细胞为对照孔50％时的药物浓度。
（6）抗病毒实验
①病毒抗原抑制实验：24孔培养板2215单层细胞培养，加入无毒浓度（TCD0）以下2倍稀释7个浓度药液，同时设细胞对照组和药物对照组，培养5、7、14天分别取上清液用波长为450nm酶标法测定HBsAg与HBeAg的A值；按下式计算药物对HBsAg、HBeAg分泌的抑制率及IC50。
抑制率＝（10％DMSO对照孔A值－阴性血清A值）／（10％DMSO对照孔A值－药物孔A值）×100％
50％抑制浓度（IC50）为HBsAg或HBeAg抑制率为50％时的药物浓度；
治疗指数（TI）＝TC50／IC50。
当11＞2时为有效，TI＝1时为低效高毒，TI＜1时为无效。
②病毒核酸抑制实验：24孔培养板2215单层细胞培养，加人无毒浓度药液培养14－15天后，将培养孔细胞用胰酶消化离心，提取总DNA，在硝酸纤维膜上用标记HBV－DNA探针进行杂交放射自显影或进行Southern Blot印染转膜，与未用药病毒感染对照比较，观察病毒DNA的抑制程度和药物抑制病毒DNA条带。
2．体外HBV－DNA多聚酶抑制实验
①HBV病毒颗粒悬液，HBsAg，HBeAg，HBV－DNA，HBV－DNA多聚酶阳性患者血清，加抗HBV血清告诉离心，分离HBV Dane颗粒。
②免疫沉淀HBV，Dane颗粒病毒悬液，加不同浓度药液，Pronase，NP－40，没反应底物及3H标dTTP，作用后测cpm值，与未加药对照组比较，计算抑制率及50％抑制浓度IC50。
（二）鸭乙型肝炎病毒实验模型
1．鸭乙型肝炎病毒DNA多聚酶和逆转录酶实验
用DHBV感染鸭血清或肝脏，分别提取DHBV－DNA多聚酶或逆转录酶，测定药物的抑制作用，DHBV－DHAP抑制实验方法同HBV－DNAP，逆转录酶实验时加放线菌素D。
2．鸭乙型肝炎病毒感染鸭肝细胞培养
用DHBV感染鸭，做肝门静脉灌流，胶原酶消化，制备DHBV感染鸭肝细胞培养，加药检测对细胞内DHBV－DNA，HBsAg，HBeAg的抑制作用。
3．DHBV感染鸭体内实验
（1）病毒鸭乙型肝炎病毒阳性鸭血清。
（2）动物1日龄北京雏鸭。
（3）阳性对照药阿糖腺苷单磷酸，ACV或PFA。
（4）感染鸭血清病毒动态测定1日龄北京雏鸭5～8天，静脉注射0．2mlDHBV阳性血清感染，感染前、后第7天、第12天、第17天及第22天取血，测定血清DHBV DNA和HBsAg，HBeAg水平。
（5）药物毒性测定在1日龄雏鸭体内，测定急性毒性LD0及LD50。按给药方案测定每天2次10天亚急性毒性LD0及LD50。
（6）抗病毒实验1日龄雏鸭取血留样，静脉感染病毒后第7天取血留样，按亚急性毒性LD0以下三个剂量给药10天；设病毒对照组，给生理氯化钠溶液；阳性药对照组给阿糖腺苷单磷酸。
①抑制血清病毒DNA，HBsAg，HbeAg：在感染前、给药前、给药后第5和10天及停药后3～5天，取鸭血分离血清，将各组鸭感染前后，治疗期间和停药后血清标本，同时做斑点杂交，测定血清DHBV－DNA量，按组计算每组鸭血清DHBV－DNA，用DHBsAb和DHBeAb EIA免疫斑点实验方法测定血清DHBsAg，DHBeAg平均水平。计算不同剂量组在给药后和停药后血清DHBV－DNA，HBsAg，HBeAg与给药前的差别和抑制率；计算给药组与病毒对照组的差别。
DHBV－DNA的检测方法：取采集的鸭血清，每批同时点膜，40ul／样，将变性后的膜室温晾干，然后放80℃烤箱中烤干。将结合RNA样品的硝基纤维素膜装入可密封的耐温塑料袋内，进行预杂交，弃去预杂交液，加入经变性的同位素标记的Glut4探针RNA于42℃作用48h。依次加入20×SSC－0．1％SDS分别在室温下洗涤10min，42℃洗涤10min，65℃洗涤10min后放置在室温中晾干，然后在－70℃曝光（即放射自显影），3－5天后冲洗胶片，显影10min，定影10min，用自来水冲洗即可。根据胶片上放射自显影的结果，用自动酶标仪检测数据后，计算每组鸭用药后不同时间血清DHBV－DNA的抑制率，比较各组鸭血清DHBV－DNA抑制率的动态变化，将治疗组DHBV－DNA抑制率分别与对照组相同时间DHBV－DNA抑制率比较。
②肝病毒DNA：如实验证明药物可抑制鸭血清DHBV－DNA，可进一步重复实验，用有效剂量治疗组与病毒对照组，在感染前、给药前（感染后7～10天）、给药后第5天、第10天及停药后3～5天，每组分别杀剖3只鸭，取血及肝脏，测定血清DHBV－DNA，计算各组平均值和给药后比给药前的抑制％。将各鸭肝提取总DNA，做southern Blot转膜放射自显影，分析药物对肝内病毒DNA复制的作用。
③肝脏病理和病毒抗原：治疗前和治疗后杀剖肝脏，切片，观察病理变化，用免疫组织化学方法做HBsAg，HBeAg和HBeAg染色，与感染对照比较，分析药物对肝内病毒抗原的抑制作用。
