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第2章 组织学与胚胎学的研究内容与意义

组织学与胚胎学是独立而又相互关联的两门学科。组织学(histology)是研究机体的微细结构及其与功能关系的科学。胚胎学(embryology)是研究出生前的个体发生和生长规律及其发育机制的科学。

人体组织学的研究内容包括细胞、组织、器官和系统。细胞是构成人体的基本结构和功能单位;组织由形态和功能相同或相似的细胞群体和细胞间质组成;几种组织按照一定的方式组合构成器官;功能相关的器官组成系统。

组织学是以显微镜观察组织切片为基本方法,故又称为显微解剖学。在一般光学显微镜下(简称光镜)所显示的结构,称光镜结构;在电子显微镜(简称电镜)下所见到的结构,称超微结构。

学习医学科学必须首先熟悉人体的结构、组成和发生发育过程。因此,组织学与胚胎学无疑是一门重要的基础医学课程。它与基础医学的其他学科和临床各学科均有密切联系。如大体解剖学是从宏观研究人体结构,而组织学则是从微观研究人体结构,二者相辅相成,缺一不可。不了解人体组织、细胞的微细结构,就不可能深入理解其生理功能和生物化学反应机制;不熟悉人体胚胎发育的过程,对诸如男性不育、女性不孕、先天畸形等疾病就不能正确地诊断和治疗。随着医学科学的发展,组织学与胚胎学已汇入生命科学各学科相互交叉的网络之中,与分子生物学、免疫学、遗传学、肿瘤学等学科相互渗透。因此,掌握好组织学与胚胎学知识,可为学习其他各学科奠定坚实的基础。

二、组织学与胚胎学的研究方法

(一)一般光学显微镜技术

光学显微镜技术是一种常用技术。取人或动物的新鲜组织标本,入固定剂(如乙醇或甲醛溶液),使组织中蛋白质迅速凝固,以尽可能保持其自然结构,此过程称为固定。固定后的标本经冲洗、脱水、浸蜡、切片等步骤后进行染色。最常用的染色方法是苏木精(hematoxylin)和伊红(eosin)染色,简称HE染色。苏木精是碱性染料(它的盐溶液具正电荷),伊红为酸性染料(其盐溶液具负电荷)。凡被苏木精着色染成蓝紫色的结构和物质,称嗜碱性物质;被伊红染成粉红色的结构和物质,称嗜酸性物质;与碱性和酸性染料亲和力均不强者,则称为中性物质。

染料名称染料性质细胞内着色部位染色被染色物质性质苏木精(H)碱性细胞核蓝紫色嗜碱性伊红(E)酸性细胞质、细胞膜粉红色嗜酸性。此外,还可以把组织直接置于低温下冰冻,直接进行切片、染色,称为冰冻切片法。该法常用于酶的组织化学研究及病理快速诊断。

血液(或体液等)可直接涂在载玻片上进行染色称涂片法;坚硬组织(如骨、牙齿等)可用磨片法;一些软组织(如疏松结缔组织)可用铺片法。

(二)电子显微镜技术

1.透射电子显微镜技术

透射电镜(transmission nlectronnicroscope,TEM)是以电子束代替光源,以电磁透镜代替光学透镜,经聚焦放大后,显像于荧光屏上进行观察和摄像。由于电子束波长甚短,故电镜的分辨率与放大倍数比光镜大得多,分辨率可达0.2nm,放大倍数可达几万倍至几十万倍。

由于电子易被物体散射和吸收,故电镜标本的制备比光镜更为严格。新鲜组织经双醛固定液(含戊二醛和多聚甲醛)和四氧化锇双重固定,树脂包埋,用超薄切片机切成30—50nm的超薄切片,用醋酸铀和柠檬酸铝染色后,电镜下观察。荧光屏上呈现黑白反差的结构图像,被重金属盐染色呈现黑色的结构,称电子密度高,反之,则为电子密度低。

2.扫描电子显微镜技术

扫描电镜(scanning glectronnicroscope,SEM)用于观察组织细胞的表面立体结构。标本表面先后喷镀一层碳膜和金属膜,即可置于电镜下观察。

(三)激光共聚焦扫描显微镜

激光共聚焦扫描显微镜(confocal laser rcanninggicroscope,CLSM)的组成部分包括激光光源、共聚焦成像扫描系统、电子光学系统和计算机图像分析系统。激光光源产生的激光束经过物镜聚焦后,对样本的不同深度进行扫描;样本反射的激光束经透镜转换成像于显示屏;计算机图像分析系统对图像进行二维或三维的分析处理。CLSM打破了普通光镜无法对细胞内部进行定位检测的限制,实现了对细胞内部非侵入式光学断层扫描成像,可用于亚细胞水平的结构和功能的研究。

(四)组织化学和细胞化学技术

组织化学(histochemistry)和细胞化学(cytochemistry)是通过化学反应或物理反应的原理显示组织细胞内某种化学成分,并可进行定位、定量研究。如欲检测组织细胞内的多糖类,可用过碘酸-Schiff反应(periodicccid dchifffeaction,PAS反应)。其基本原理是多糖经过碘酸(HIO4)氧化成多醛,后者与Schiff试剂(无色品红)结合形成紫红色沉淀物,沉淀物形成部位则表示多糖存在的部位,颜色反应的深浅取决于组织内多糖的含量。

组织化学反应分类显示物质反应原理PAS反应多糖类多糖经过碘酸氧化形成多醛,多醛与Schiff试剂结合形成紫红色沉淀物免疫组织化学多肽、蛋白质抗原-抗体特异性结合原位杂交组织化学核酸分子碱基互补的单核苷酸链结合形成稳定的杂交体。

用Feulgen反应可显示DNA;用甲基绿-派若宁染色法可同时显示DNA和RNA;用苏丹染料可显示脂类;用酶组织化学方法可显示酶类。

(五)免疫组织化学技术

免疫组织化学(immunohistochemistry)技术是应用抗原与抗体特异性结合的原理,检测组织细胞内多肽和蛋白质等大分子物质的技术。分离和纯化人或动物某种组织的蛋白质,作为抗原免疫动物,即可制备相应的特异性抗体。将这种抗体用荧光素、铁蛋白、酶等标记,用这种标记的抗体孵育标本,标记抗体即与细胞的相应蛋白质(抗原)发生特异性结合。这种方法称为直接法。另一种方法是间接法:将分离的抗体(一抗)作为抗原免疫另一种动物,制备该抗体的抗体(二抗),然后对二抗进行标记。先后用一抗和标记二抗处理组织标本,最终形成抗原-一抗-标记二抗复合物。间接法由于二抗的放大作用而较直接法敏感性高。目前常用的间接法有过氧化物酶-抗过氧化物酶复合物法(peroxidase-antiperoxidaseeomplex xethod,PAP法)和亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法(avidin-biotin-peroxidase eomplexxethod,ABC法)。

1.PAP法的原理是一抗同抗原相结合,二抗既能同一抗相结合,又能同PAP复合物相结合,后者由过氧化物酶和抗过氧化物酶抗体组成,最后以DAB显色。由于细胞内的抗原通过抗体的层层放大而与多个酶分子结合,因此敏感性高。

2.ABC法的原理是生物素与亲和素具有极高的亲和力,较抗原——抗体的亲和力高10000倍以上。用一抗同抗原结合,生物素化的二抗再与一抗结合,最后用亲和素-生物素-过氧化物酶复合物处理,使复合物同生物素化的二抗结合,显色部位即表明抗原存在的部位。由于最终形成的复合物结合了大量的酶分子,因此该方法较PAP法敏感20—40倍。现有ABC试剂盒供应,操作简便。

(六)原位杂交组织化学技术

原位杂交组织化学(in nitu uybridizationnistochemistry)简称原位杂交,可在组织细胞原位检测核酸分子。其基本原理是两条互补的单核苷酸链可紧密结合形成稳定的杂交体。碱基序列已知的标记核苷酸链称为探针,常用的标记物分放射性和非放射性两类。放射性标记物用放射自显影术显示,非放射性标记物可用组织化学术显示。

(七)冷冻蚀刻复型

冷冻蚀刻复型(freeze etchheplica)是用透射电镜观察组织或细胞断裂面的金属复制膜。组织经甘油处理后快速冷冻(-190℃),高真空下用钢刀将组织劈开,升温至-100℃使组织升华,出现自然的凸凹面。先喷镀一层铂膜,再喷一层碳膜,以加固铂膜。用次氯酸等将组织腐蚀掉,清理复型,电镜观察。其凸凹结构影像恰与实物相反。此法可以观察细胞膜内部两层脂质分子间的结构。

(八)细胞培养技术

将人或动物体的活细胞在体外适宜的环境中(如温度、pH值、营养等)培养生长的技术称为细胞培养技术。细胞培养技术可应用于细胞增殖、分化、代谢、吞噬及癌变机制等多方面的研究,获得体内实验难以达到的目的,已成为细胞学研究的重要手段之一。

观察活细胞的结构和变化,可用相差显微镜。它能改变光波的相位,使相位差变为振幅差,从而能清楚地观察不经染色的活细胞。

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