由于蛋白质分子中含有肽键(-CO-NH-)，与双缩脲结构相似，故也能呈现此反应而生成紫红色的配合物，在一定条件下其颜色深浅与蛋白质含量成正比，据此可用吸收光度法来测定蛋白质含量，该配合物的最大吸收波长为560 nm。
样品中蛋白质含量根据下列公式计算。
X＝m0×100m
式中：X——样品中蛋白质的含量，mg/100 g；
m0——由标准曲线查得的蛋白质质量，mg；
m——样品的质量，mg。
说明及注意事项如下。
(1)有大量脂类物质共存时，会产生混浊的反应混合物，可用乙醚或石油醚脱脂后测定。
(2)在配制试剂加入硫酸铜溶液时必须剧烈搅拌，否则会生成氢氧化铜沉淀。
(3)蛋白质的种类不同，对发色程度的影响不大。
(4)当样品中含有脯氨酸时，若有大量糖类共存，则显色不好，测定结果偏低。
双缩脲法灵敏度较低，但操作简单快速，故在生物化学领域中测定蛋白质含量时常用此法。双缩脲法亦适用于豆类、油料、米谷等作物种子及肉类等样品的测定。
11.2.2.2紫外分光光度法
蛋白质及其降解产物的芳香环残基（NHCHRCO）在紫外区内对一定波长的光具有选择吸收作用。在280 nm波长下，光吸收程度与蛋白质浓度(3～8 mg/mL)呈直线关系，因此，通过测定蛋白质溶液的吸光度，并参照事先用凯氏定氮法测定蛋白质含量的标准样所作的标准曲线，即可求出样品的蛋白质含量。
样品中蛋白质含量根据下列公式计算：
X＝m′m×100
式中：X——样品中蛋白质的含量，mg/100 mg；
m′——由标准曲线查得的蛋白质质量，mg；
m——测定样品溶液所相当于样品的质量，mg。
说明及注意事项如下。
(1)测定牛乳样品时的操作步骤为：准确吸取混合均匀的样品0.2 mL，置于25 mL纳氏比色管中，用95%～97%的冰乙酸稀释至标线，摇匀，以95%～97%冰乙酸为参比液，用1 cm比色皿于280 nm处测定吸光度，并用标准曲线法确定样品蛋白质含量（标准曲线以采用凯氏定氮法已测出牛乳标准样的蛋白质含量绘制）。
(2)测定糕点时，应将表皮的颜色去掉。
(3)温度对蛋白质水解有影响，操作温度应控制在20～30℃。
紫外分光光度法操作简便、迅速，常用于生物化学研究，但由于许多非蛋白质成分在紫外光区也有吸收作用，加之光散射作用的干扰，故在食品分析领域中的应用并不广泛，最早用于测定牛乳的蛋白质含量，也可用于测定小麦、面粉、糕点、豆类、蛋黄及肉制品中的蛋白质含量。
11.2.2.3染料结合法
在特定的条件下，蛋白质可与某些染料（如胺墨10B或酸性橙12等）定量结合而生成沉淀，用分光光度计测定沉淀反应完成后剩余的染料量，即可计算出反应消耗的染料量，进而可求得样品中蛋白质含量。
说明及注意事项如下。
(1)取样要均匀。
(2)绘制完整的标准曲线可供同类样品长期使用，而不需要每次测样时都作标准曲线。
(3)脂肪含量高的样品，应先用乙醚脱脂，然后再测定。
(4)在样品溶解性能不好时，也可用此法测定。
(5)本法具有较高的经验性，故操作方法必须标准化。
(6)本法所用染料还包括橙黄G和溴酚蓝等。
(7)本法适用于牛乳、冰激凌、酪乳、巧克力饮料，脱脂乳粉等食品。
11.2.2.4水杨酸比色法
样品中的蛋白质经硫酸消化而成铵盐溶液后，在一定的酸度和温度条件下可与水杨酸钠和次氯酸钠作用生成蓝色的化合物，可以在波长660 nm处比色测定，求出样品含氮量，进而可计算出蛋白质含量。
样品中含氮量根据下列公式计算。
N＝m0×Km×1000×1000×100
式中：N——样品中含氮量，g/100g；
m0——从标准曲线查得的样品的含氮量，μg；
m——样品的质量，g；
K——样品溶液的稀释倍数。
样品中蛋白质含量根据下列公式计算：
X＝N×F
式中：X——样品中蛋白质的含量，g/100 g；
F——蛋白质系数。
说明及注意事项如下。
(1)样品消化完成后当天进行测定结果的重现性好，样液放至第二天比色即有变化。
(2)温度对显色影响极大，故应严格控制反应温度。
(3)对谷物及饲料等样品的测定证明，此法结果与凯氏定氮法基本一致。
11.3氨基酸的测定方法
11.3.1双指示剂甲醛滴定法
氨基酸含有酸性的 COOH基，也含有碱性的-NH2，它们相互作用使氨基酸成为中性的钠盐，不能直接用碱液滴定它的羧基。当加入甲醛时，-NH2与甲醛结合，其碱性消失，使COOH基显示出酸性，可用氢氧化钠标准溶液滴定。
用此法滴定的结果表示α-氨基酸态氮的含量，其精确度仅达氨基酸理论含量的90％。如果样品中只含有某一种已知的氨基酸，从甲醛滴定的结果可算出该氨基酸的含量。如果样品是多种氨基酸的混合物（如蛋白水解液），则滴定结果不能作为氨基酸的定量依据，但一般常用此法测定蛋白质水解程度，当水解完成后，滴定值不再增加。但应注意，脯氨酸与甲醛作用产生不稳定的化合物，使结果偏低；酪氨酸含有酚羟基，滴定时要消耗一些碱，使结果偏高；溶液中若有铵存在也可与甲醛反应，使结果偏高。
样品中氨基酸含量根据下列公式计算：
X＝(V2－V1)×C×0.014V×100
式中：X——氨基酸含量，g/100 mL；
V1——中性红作指示剂时消耗氢氧化钠标准液的体积，mL；
V2——百里酚酞作指示剂时消耗氢氧化钠标准液的体积，mL；
C——氢氧化钠标准液的浓度，mol/L；
V——样品液取用量，mL；
0.014——氮的毫摩尔质量，g/mmol。
说明及注意事项如下。
(1)此法适用于测定食品中的游离氨基酸。
(2)固体样品应先进行粉碎，准确称样后用水萃取，然后测定萃取液；液体试样如酱油、饮料等可直接吸取试样进行测定。萃取可在 50℃ 水浴中进行 0.5 h 即可。
(3)若样品颜色较深，可加适量活性炭脱色后再测定，或用电位滴定法进行测定。
(4)与本法类似的还有单指示剂（百里酚酞）甲醛滴定法，此法用标准碱完全中和COOH基时的pH值为 8.5～9.5，但分析结果稍偏低，即双指示剂法的结果更准确。
11.3.2电位滴定法
本法根据酸度计指示 pH 值控制滴定终点，适合有色样液的检测。
样品中氨基酸含量根据下列公式计算：
X＝(V1－V2)×C×0.0145×V×100
式中：X——氨基酸含量，g/100mL；
V1——测定用样品加入甲醛稀释后消耗氢氧化钠标准液，mL；
V2——试剂空白试验加如甲醛后消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL；
C——氢氧化钠标准液的浓度，mol/L；
V——样品稀释液取用量，mL；
0.014——氮的毫摩尔质量，g/mmol。
说明及注意事项如下。
(1)本法准确快速，可用于各类样品游离氨基酸含量测定。
(2)对于混浊和色深样液可不经处理而直接测定。
11.3.3茚三酮比色法
氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮作用，生成蓝紫色化合物（除脯氨酸外均有此反应），该蓝紫色化合物的颜色深浅与氨基酸含量成正比，其最大吸收波波长为570 nm，据此可以用吸光光度法测定样品中氨基酸含量。
样品中氨基酸含量根据下列公式计算：
X＝cm×1000×100
式中：X——氨基酸含量，μg/100g；
c——从标准曲线上查得的氨基酸的含量，μg；
m——测定的样品溶液相当于样品的质量，g。
说明及注意事项如下。
茚三酮在放置过程中易被氧化呈淡红色或深红色，使用前须进行纯化。方法为：取10 g茚三酮溶于40 mL热水中，加入1 g活性炭，摇动1 min，静置30 min，过滤；将滤液放入冰箱中过夜，即出现蓝色结晶，过滤，用2 mL冷水洗涤结晶，置干燥器中干燥，装瓶备用。
11.3.4氨基酸自动分析仪法
食物蛋白质经盐酸水解成为游离氨基酸，经氨基酸分析仪的离子交换柱分离后，与茚三酮溶液产生颜色反应，再通过分光光度计比色测定氨基酸含量。可同时测定天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸和精氨酸16种氨基酸，其最低检出限为10 pmol。
测定在氨基酸自动分析仪上完成，可控制的操作条件包括缓冲液流量、茚三酮流量、柱温、色谱柱规格。
上机样品液中氨基酸总量根据下列公式计算：
N＝c×A1A0
式中：N——上机样品液中氨基酸量，nmol/50 μL；
c——上机标准液中氨基酸量，nmol/50 μL；
A1——样品峰面积；
A0——氨基酸标准峰面积。
样品中氨基酸含量根据下列公式计算：
X＝N×f×Mr×100m×V×106
式中：N——上机样品液中氨基酸量，mg/100 g；
f——样品的稀释倍数；
Mr——氨基酸的相对分子质量；
m——样品的质量，g；
V——上机时的进样量（此处为50 μL）。
说明及注意事项如下。
(1)样品中氨基酸的含量在1.00 g/100 g以下，保留两位有效数字；含量在1.00 g/100 g以上，保留三位有效数字。
(2)16种氨基酸相对分子质量；天冬氨酸133.1；苏氨酸119.1；丝氨酸105.1；谷氨酸147.1；脯氨酸115.1；甘氨酸75.1；丙氨酸89.1；缬氨酸117.2；蛋氨酸149.2；异亮氨酸131.2；亮氨酸131.2；酪氨酸181.2；苯丙氨酸165.2；组氨酸155.2；赖氨酸146.2；精氨酸174.2。
(3)标准出峰顺序和保留时间见表11-2。
(4)本法为国家标准食物中氨基酸的测定方法，适用于食物中的16种氨基酸的测定，最低检出限为10 pmol。但本方法不适用于蛋白质含量低的水果、蔬菜、饮料和淀粉类食物的测定。
复习思考题
1.凯氏定氮法测定蛋白质的原理及主要步骤是什么？
2.凯氏定氮法测定蛋白质时可用哪些助剂？其作用是什么？
3.双缩脲法测定蛋白质的原理、主要步骤及注意事项是什么？
4.水杨酸比色法测定蛋白质的原理、主要步骤及注意事项是什么？
5.紫外分光光度法测定蛋白质的原理、主要步骤及注意事项是什么？
