征服了威胁牛羊的炭疽病，巴斯德又满怀信心地向威胁人类健康的疾病挑战。
为了研究霍乱病，巴斯德有一位年轻的助手深入霍乱流行地区，不幸染病去世，巴斯德为此难过了好一阵子。可这令人悲痛的意外事件，并没有动摇他，更坚定了他要去战胜传染病的决心。
也许是童年时期对狂犬病恐怖的记忆，导致他在众多的传染病中把主攻方向对准狂犬病。
1880年时，巴斯德就开始着手狂犬病的研究了。第一步是要找到狂犬病的病原微生物，巴斯德收集了一个死于狂犬病的孩子的唾液，在其中发现了一种微生物，他用这些唾液注射在兔子身上，兔子死了。可这种微生物就是狂犬病的病原微生物吗？为什么用唾液接种后动物死亡很快，而狂犬咬伤后却有很长一段潜伏期呢？他们又检查了死于其他病症的人甚至是健康人的唾液，也常能发现这种微生物。于是，问题澄清了，这种微生物不是狂犬病的病原微生物。
事实上，狂犬病的病原微生物是病毒，病毒极小，只有用电子显微镜才能看到，在当时，巴斯德他们是无法找到的。
找不到病原微生物并不能阻止巴斯德的进一步研究，他开始采取较为危险的行动——直接从狂犬口中收集唾液，注射给兔子。
然而这种方法总是令人焦躁不安，因为它的潜伏期很长，常常是几个月都过去了，而人们还在焦急地等待结果。显然，唾液不是很好的病毒来源。
巴斯德对狂犬及狂犬病患者的表面症状做了大量的观察和分析，他认为这种看不见的敌人一定是袭击了神经系统，这种病毒开始时在身体其他组织内存在，最后侵入到神经系统。于是巴斯德用狂犬的延髓给狗和兔子接种，果然使它们都患上了狂犬病，但也有一个较长的潜伏期。
不知什么突然拨动了他的灵感，这些病毒在身体其他部位存活最终侵袭了脑，那么为什么不能直接将病毒接种在脑子里呢？他对鲁和尚贝朗说：“我们也许可以用动物的脑子来代替一瓶肉汤培养基……可惜我们无法把病毒直接送到狗脑子里去……”
鲁和尚贝朗马上说：“我可以环锯狗的头颅，决不损伤它的脑子，这样就可以接种了。”
“不行，你会把这个可怜的家伙害死，它会瘫痪的，我不允许这样做！”一时的仁慈几乎断送了他又一伟大的发现。
可鲁和尚贝朗并没有放弃这个想法，一天他乘巴斯德不在，真的环锯了一只狗的头颅，并注射进去一点狂犬的脑子。
当巴斯德看到鲁和尚贝朗成功地实施了这一手术后，十分满意。不到两周，这条狗开始嚎叫，乱咬笼子，最后死于狂犬病。
他们找到了繁殖狂犬病毒的最好方法，接下来就是一次又一次的接种，连续一百次接种后，潜伏期缩短到了7天，此时的病毒毒力很大。接种的成功和潜伏期的缩短这两个进展并没有使巴斯德满足，他要找的是征服这种病毒的方法。
他们与看不见的敌人展开了较量，一百次接种总会导致一百次死亡，怎样才能使病毒减毒呢？
巴斯德想到把带病毒的延髓放上一段时间也许会使毒力减少，于是他从一只死于狂犬病的兔脑中取出一片延髓，用线绳吊在消过毒的瓶子里，瓶底放置几块氢氧化钾以脱去空气中的水分，瓶口用棉球塞住以防大气中的灰尘落入瓶内。然后，将放置了14天的延脑捣碎掺上水给狗注射，第二天再将放置了13天的给狗注射，连续接种下去，最后一天使用了当天死亡的兔子的延髓。然后将连续接种过的狗无论是放入狂犬笼中任其被咬还是进行颅内接种，都不能使这样的狗再患狂犬病了。
整整3年的辛勤探索，终于有了结果，巴斯德兴奋异常，他脑子里策划着大规模的接种计划。他向一位兽医权威建议，用减毒延髓给全国的狗接种，这位兽医哈哈大笑：“全国250万只狗，如果每只要连续14天注射你的疫苗14次，你到哪里找人手？哪里有这么多的时间！天知道你到哪里去找来那么多的兔子？”
巴斯德思量起来，一个被狂犬咬伤的人总有几个星期的潜伏期，我们是否可以在这一时期给人接种疫苗呢？巴斯德让鲁和尚贝朗将疯狗放入健康狗的笼子里，任其乱咬，然后马上给被咬的狗注射疫苗。14天后，巴斯德和助手们进入了焦急的等待，1周，2周，1个月过去了，狗安全无恙，可巴斯德他们却熬尽了心血，常常是彻夜不眠。巴斯德夫人写信告诉孩子：“你父亲全神贯注于他的思考中，说话很少，睡眠很少，天一亮就起床，一句话，还是继续我在35年前的今天开始与他共同生活时的那种生活。”巴斯德连他们结婚35周年纪念日也忘得一干二净。
几个月过去了，这只被狂犬咬伤又接种了疫苗的狗十分正常，他们又一次成功了，巴斯德立即将这一成果向教育部长报告，请求他有一个委员会进行鉴定。这个委员会由医学界的权威构成，他们立即投入工作，2个月后，他们向教育部长送上报告，证明巴斯德预防狂犬病的方法是可信的。
1884年，巴斯德再一次代表法国出席在哥本哈根举行的国际医学大会。
他代表法兰西发言：“我们大家出席了这次大会，证明科学是中立的。科学不分国界。但是，科学家却应该记住，要尽一切努力为祖国争光。在每一个伟大的科学家身上都可以同时看到他是一个伟大的爱国者。”接着，他报告了他战胜狂犬病所走过的历程，当他宣读完论文，整个会场沸腾起来，大家报以长久而热烈的掌声。
巴斯德名声大振，从世界各地发来的信件堆满了巴斯德的实验台，人们请求他救救他们的亲人。把疫苗用在人身上，巴斯德一想起这些就头皮发麻，这不像炭疽病菌苗，即使有什么差错也只不过是损失几头牛羊，这是人命关天的大事，半点马虎不得。巴斯德实在为难，他又开始夜不成眠了，只要一闭上眼睛，就会出现种种可怕的情景：孩子痉挛着死在自己的手上……
巴斯德甚至要拿自己做实验，他在给老朋友的信中说：“我真想在自己身上试验：用狂犬病接种，然后控制其后果；因为我已经感到自己的试验是万无一失的。”
就在这时，一位焦急的母亲领着9岁的儿子梅斯特来到巴斯德实验室，请求巴斯德救救他的孩子。原来，两天前梅斯特在上学的路上被疯狗咬伤达14处之多。剧烈的伤痛已使孩子无法行走。怎么办？巴斯德有些犹豫，能不能给孩子使用疫苗？后果会怎样？万一失败了，一直在寻找战机的对手们会群起而攻击，但不接种，孩子必死无疑。对于巴斯德来说，保全自己的声誉完全无法与抢救孩子的生命这种责任感相比。
1885年7月6夜里，人类揭开了战胜狂犬病的新的篇章，巴斯德给小梅斯特注射了第一针，此后连续14天的接种，连续14天的心神不宁，巴斯德又一次失眠了，可他不能退却，只有坚持。在这场从死神手中夺回孩子的搏斗中，巴斯德经历了一连串的希望、忧虑、痛苦和焦急。
一天天过去了，孩子的伤好了，一切都很正常，巴斯德成功了，现在他开始着手组织建立预防狂犬病的研究机构。
10月，又来了一位小患者——羊倌朱皮叶，这是一个勇敢的孩子，当几个小伙伴一起放羊时，一只疯狗冲过来，孩子们四散奔逃，朱皮叶却挺身而出，与疯狗展开了搏斗，厮打在一起，最后终于将狗压倒在地，在弟弟的帮助下打死了疯狗，可他的左手被严重咬伤。当地的人们为小朱皮叶的事迹所感动，市长亲自写信给巴斯德请求帮助。尽管孩子已经被咬6天了，但巴斯德仍然充满信心，他认为6～8天内接种都可以有效。小朱皮叶真的得救了，他很快养好伤，一切正常。
巴斯德把这一成功在科学院进行报告，科学院院长激动地说：“我们有权说，这次会议的日期将在医学史上永远值得纪念，在法国科学史上永放光辉；因为，这是在医学史上迈出的最巨大的一步……从今天起，人类掌握了战胜狂犬病这一致命的顽症、抵御其进攻的武器。这—切都归功于巴斯德先生……”
11月，又来了一个10岁的女孩，她被疯狗咬伤已达37天，巴斯德犯难了，这时预防接种已没有什么希望了，万一失败，别人还会来吗？出于对这一新疗法的保护，不应该为她接种，可巴斯德无法对孩子的性命之危无动于衷，他还是给她接种了，但小女孩还是在1个月后发病了。巴斯德守在孩子的身边久久不愿离去，“我真希望能救治你们的孩子！”巴斯德对孩子的父母说着，禁不住泪水夺眶而出。
反对者们果然又开始洋洋得意了，他们认为小女孩的死会吓跑别的病人，但事实并非如此，人们仍然从四面八方来到这里。
4个美国病儿靠募捐集资被送来了，当他们健康地回到纽约时，受到了热烈的欢迎。
19名俄国农民来了，他们受到疯狼的袭击已经两周了，过了预防接种期，巴斯德为了争取时间，决定每天为他们注射两针。尽管有3个人死亡，反对者们又开始喋喋不休，但不怀偏见的人仍然为此而欢呼，因为如果不进行治疗的话，这19名俄国人按过去的统计发病率应有16名死亡。
16名幸存者回到俄国，引起轰动，沙皇为此委托他的弟弟送来了圣安妮十字勋章，并为巴斯德研究所捐赠了10万法郎。
一切热爱科学、热爱真理的人都为巴斯德欢呼，人们自发地组织起来为巴斯德研究所捐款，其中有百万富翁，也有穷困的工人，有科学家、医生等，还有妇女和儿童，当巴斯德在私人捐款的名单中看见了他第一个患者小梅斯特的名字时，真是又惊喜又感动。
巴斯德关心着他的每一位病人，并一直与小梅斯特和小朱皮叶有通信联系，他总是鼓励他们好好学习，长大做个有用的人。
1888年10月底，巴斯德的研究所在来自各方面的支持下，终于竣工了。巴斯德邀请共和国总统前来主持落成典礼，总统答复说：“我一定前往，你的研究所是法兰西的光荣。”
11月14日，人们聚集在新研究所的图书馆里，召开了隆重的庆祝大会，人们颂扬巴斯德，颂扬他为人类做出的伟大贡献。
这是多么令人激动的场面啊！巴斯德嘴唇颤抖着说不出话来，只好让他的儿子代读发言稿。
尽管巴斯德的身体已渐渐不支，但他的热情却不减，他对科学的爱是无止境的。
