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第28章 DNA是如何复制的?

DNA分子的复制模式是怎样的?

在构建DNA分子的结构模型时,两位科学家沃森和克里克事实上已经提供了DNA分子的复制模式。他们充分了解DNA双螺旋的两条链互补(碱基配对)的重要性,这是DNA复制模式的基础。复制时,DNA双螺旋就像拉开拉链那样,两条链的配对碱基之间的氢链断开,碱基暴露出来,这就形成了两条“模板链”(母链)。然后作为合成原料的游离核苷酸按碱基配对的原则结合到模板链上去。最后,结合到模板链上各有一条新链(子链)形成,原来的一个双螺旋DNA分子就变成(复制)了两个双螺旋分子。这两个双螺旋分子中各含有一条母链和一条子链。DNA的这种复制方式称为“半保留复制”。在沃林和克里克1953年的原始论文中有关于DNA半保留复制模式推测的一段话:“我们的DNA模型实际上是一对模板,每一模板与另一个互补。我们设想:在复制前氢键断开,两条链松开、分离,然后每条链作为形成自己新链的模板,最后我们从原先仅有的一对链得到了两对链,而且准确地复制了碱基序列。”真是天才的推测!这一推测的DNA复制模式,后来得到了实验事实的充分证明。1957年,泰勒等人应用放射性标记的胸腺嘧啶与放射自显影技术,证明蚕豆根尖染色体的半保留复制。1958年,梅塞尔森和斯塔尔应用重氮标记与密度离心技术,证明大肠杆菌DNA的半保留复制。后来关于DNA分子复制的细节又有了更多的了解。1968年,日本生化学家冈崎等人发现DNA是“不连续”复制的。复制时,先在DNA模板链上合成一些短的片段,然后再连接成与母链等长而且互补的新链。DNA合成过程中的这些短片段,后来被称为“冈崎片段”。每一冈崎片段的合成都需要DNA多聚酶的作用。但DNA多聚酶只能把单个的核苷酸连接到已形成的核苷酸链上。因此,每一新的片段合成时,需要有一个已存在的片段作为“引物”。目前,已经可以在试管中人工复制DNA。这个体外的生化反应称为多聚酶链式反应(简称PCR)。这个反应大致是这样进行的:将DNA模板、多聚酶、作为合成原料的4种脱氧核苷酸和引物一起加入到一种特制的薄壁塑料管中。之所以要用薄壁管,是为了便于传热。先将试管置于90℃的高温中约20秒,使DNA模板拆开成两条链(这叫“变性”)。然后将试管转置于55℃的环境中约20秒,使一对引物分别结合到两条分开的模板上去。再在72℃的温度下放置约30秒,使单核苷酸从引物的一端一个接一个地连接上去,从而复制两条新链。于是,一个DNA双螺旋分子便复制成了两个。再重复一个上述的温度循环,两个便复制成四个,……如此循环下去,便可以得到大量的DNA分子。例如20次循环就可使DNA扩增至100万倍。这一切,都可以在带电脑控制的PCR仪内进行,非常方便。

最初的PCR技术有什么缺点?

以后的几个月里,缪里斯反复进行实验,结果表明PCR技术是可行的。1984年春,缪里斯贴出一张海报,叙述了PCR技术,但未能引起广泛注意。唯一感兴趣的人是细菌遗传学家、诺贝尔奖获得者、当时洛克菲勒大学的校长里德伯格。

最初的PCR技术有一个缺点,就是DNA多聚酶不耐热,在90℃以上的高温即失活。因此,反应过程中要不断添加新的DNA多聚酶。这不利于实现反应的自动化。1969年,有人从美国黄石国家公园温泉中的水生栖热菌体内分离纯化出了耐热的DNA多聚酶,后来的商品名叫Taq酶。1988年,西特斯公司的研究者们开始在PCR中使用Taq酶。这是PCR技术的重大改进,在此基础上实现了反应的自动化,从而PCR技术得到了极为广泛的应用。而缪里斯也因发明PCR技术而荣获1993年的诺贝尔化学奖。

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